帶myc標簽的人造血相關PBX相互作用蛋白真核表達載體的構(gòu)建及其功能研究

李玲，閆志風，蔣昊，馮瀅瀅，冀全博，黃蓉，周麗英，王鵬，徐小潔，葉棋濃

1.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850；2.解放軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100853；3.第二炮兵總醫(yī)院，北京 100088

造血相關PBX相互作用蛋白（hematopoietic PBX-interacting protein，HPIP）是 2000年 Abramov?ich 等[1]以 PBX1（hematopoietic pre-B-cell leukemia transcription factor 1）作為誘餌，利用酵母雙雜交技術從胎兒肝臟cDNA文庫中篩選得到的。2002年DiMartino等[2]報道，HPIP參與維持胚胎期造血干細胞的定向分化和成熟血細胞正常的有絲分裂，能夠強烈抑制原癌基因E2A-PBX與DNA的模序（AT?CAATCAA）結(jié)合，調(diào)節(jié)造血干細胞正常生長分化過程。2006年Manavathi等[3]揭示HPIP能夠與雌激素受體α及微管相互作用并磷酸化AKT和MAPK，因此它在雌激素受體信號通路中具有重要作用。2013年本實驗室[4]研究表明，miR-148a能降低HPIP在肝癌細胞中的表達水平，并通過AKT/ERK/FOXO4/ATF5途徑抑制AKT和ERK，進而抑制mTOR的表達。

我們擬構(gòu)建帶myc標簽的HPIP真核表達載體，并驗證其升高磷酸化AKT和ERK水平的功能，為進一步研究HPIP在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細胞系HepG2由本室傳代培養(yǎng)；質(zhì)粒pcDNA3.0-HPIP、pXJ-40-myc載體為本實驗室保存；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、PCR試劑均購自Ta?KaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收、PCR回收試劑盒購自Promega公司；VigoFect為威格拉斯生物技術有限公司產(chǎn)品；DMEM及小牛血清均購自Gibco公司；引物由北京賽百盛生物技術有限公司合成；測序由北京博邁德科技發(fā)展有限公司完成。

1.2 myc-HPIP重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測序

以pcDNA3.0-HPIP質(zhì)粒為模板，根據(jù)文獻報道的HPIP的編碼序列合成上游引物（5'-CGGGATCC ATGGCCTCCTGCCCAGACTCTG-3'）和 下 游 引 物（5'-CCCAAGCTTTCAGCCCCGGTGGTGGTGGTGG-3'）。利用PCR方法擴增人HPIP的編碼序列（擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸150 s，30個循環(huán)；72℃延長7 min），最后用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pXJ-40-myc載體，經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ和HindⅢ酶切，形成帶有粘端的雙鏈，用DNA T4連接酶連接到pXJ-40-myc載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送北京博邁德科技發(fā)展有限公司測序。

1.3 哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測

按常規(guī)方法進行轉(zhuǎn)染。用含雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將HepG2細胞接種于2個6 cm皿中，接種量以轉(zhuǎn)染時細胞密度達70%～80%為宜，培養(yǎng)24 h后進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h換液。將4 μL VigoFect與200 μL NaCl混合，再將總量為10 μg的重組質(zhì)粒與200 μL NaCl混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉(zhuǎn)染空pXJ-40-myc載體作為對照，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h后換液，24 h后收集細胞，加入2×SDS上樣緩沖液煮沸15 min，高速離心2 min，取上清液進行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP標記的抗myc標簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

若顯影結(jié)果顯示myc-HPIP表達，再行Western印跡至4℃封閉1 h后，加入用5%脫脂奶粉以1∶500稀釋的抗pAKT（Thr308）的兔多克隆抗體、抗總AKT的鼠單克隆抗體及抗pERK（Thr202/Tyr204）的鼠單克隆抗體、抗總ERK的兔多克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；加入用5%脫脂奶粉稀釋的以1∶2000稀釋的HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學發(fā)光法顯色10 min，壓片顯影。

2 結(jié)果

2.1 myc-HPIP重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以pcDNA3.0-HPIP質(zhì)粒為模板，PCR擴增人HPIP的編碼序列，獲得長約2100 bp的DNA片段，與預期大小一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與用經(jīng)同樣酶切的pXJ-40-myc載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑克隆后進行菌液PCR鑒定，若獲得與目的條帶2100 bp大小接近（圖2）的克隆，則初步認為是帶有人HPIP基因的陽性重組克隆。將所得陽性克隆提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和2100 bp的條帶，而相應的空載體酶切只見大片段，符合預期結(jié)果（圖3）。測序結(jié)果表明，插入片段的DNA序列與人HPIP基因的編碼序列完全一致（序列略）。

2.2 Western印跡檢測myc-HPIP在HepG2細胞中的表達

圖1 PCR擴增人HPIP的編碼序列

將構(gòu)建的myc-HPIP重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞系，24 h后提取蛋白進行SDS-PAGE，Western印跡檢測myc-HPIP的表達。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，用myc-HRP抗體能在相對分子質(zhì)量約100×103處檢測到明顯的特異性條帶，空載體無條帶（圖4）；與空載體對照相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后總的AKT、ERK水平保持不變，但磷酸化AKT、ERK的水平升高（圖4）。說明myc-HPIP重組蛋白在HepG2細胞中能夠正確表達，且能升高AKT、ERK的磷酸化水平。

3 討論

圖2 重組質(zhì)粒myc-HPIP的菌液PCR結(jié)果電泳圖譜

圖3 重組質(zhì)粒myc-HPIP的BamHⅠ/HindⅢ雙酶切電泳圖譜

圖4 Western印跡檢測myc-HPIP和磷酸化AKT、ERK的表達

HPIP包含731個氨基酸殘基，目前沒有發(fā)現(xiàn)與已知蛋白有同源性。HPIP主要位于細胞質(zhì)中，只有少量位于細胞核中。HPIP具有抑制PBX-HOX二聚體與靶序列結(jié)合的能力，能強烈抑制原癌基因E2APBX的轉(zhuǎn)錄活性[1,3,5]。

研究表明，HPIP在乳腺癌細胞的細胞遷移和增殖作用中具有重要作用[6-7]。雌激素受體在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用[8-10]。PI3K/Akt信號通路作為細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導通路之一，通過影響下游多種效應分子的活化狀態(tài)，在細胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進增殖的關鍵作用，與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[10]。Akt是細胞生存通路PI3K/Akt中的關鍵分子，其持續(xù)活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，現(xiàn)已被定義為癌基因。Akt的Ser473、Thr308個位點在 P13K（phosphatidylinositol-3 kinase，磷脂酰肌醇-3激酶）、PDK1（3-phosphoinositide-dependent kinase-1，3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1）、ILK（inte?grin linked kinase，整合素連接激酶）的作用下發(fā)生磷酸化從而獲得活性[11]。活化狀態(tài)的Akt通過磷酸化mTOR、Foxo家族等多種作用底物，促進腫瘤細胞的生長增殖，抑制細胞凋亡，促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，促進血管生成，抵抗化療和放療中細胞的凋亡。

在信號網(wǎng)絡中，絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號傳遞途徑起著極為重要的作用，控制著細胞的多種生理過程，如細胞生長、發(fā)育、分裂、死亡等[12]。胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是MAPK家族的一員，調(diào)節(jié)著細胞的增殖、分化和存活，是多種生長因子的下游蛋白，ERK及其信號途徑在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[13]。

HPIP已被證明在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其促進癌細胞生長、調(diào)節(jié)癌細胞增殖的確切機制尚不清楚。在本研究中，我們將構(gòu)建的myc-HPIP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞后獲得表達，以便進行下一步的功能實驗。檢驗AKT、MAPK信號通路中總AKT、總ERK及磷酸化AKT、磷酸化pERK的水平變化，發(fā)現(xiàn)總AKT、ERK水平不變，而磷酸化的AKT、ERK水平上調(diào)，與文獻報道一致[4]。總之，本研究結(jié)果為進一步了解HPIP的生物學功能，及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定了基礎。

[1]Abramovich C,Shen W F,Pineault N,et al.Functional clon?ing and characterization of a novel nonhomeodomain protein that inhibits the binding of PBX1-HOX complexes to DNA[J].Biol Chem,2000,275(34):26172-26177.

[2]DiMartino J F,Swlleri L,Traver D,et al.The Hox cofactor and proto-oncogene Pbx1 is required for maintenance of defin?itive hematopoiesis in the fetal liver[J].Blood,2002,98(4):618-626.

[3]Manavathi B,Acconcia F,Rayala S K,et al.An inherent role of microtubule network in the action of nuclear receptor[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(43):15981-15986.

[4]Xu X,Fan Z,Kang L,et al.Hepatitis B virus X protein re?presses miRNA-148a to enhance tumorigenesis[J].J Clin In?vest,2013,123(2):630-645.

[5]Abramovich C,Chavez E A,Lansdorp P M,et al.Functional characterization of multiple domains involved in the subcellu?lar localization of the hematopoietic Pbx interacting protein(HPIP)[J].Oncogene,2002,21(44):6766-6771.

[6]Manavathi B,Lo D,Bugide S,et al.Functional regulation of pre-B-cell leukemia homeobox interacting protein 1(PBXIP1/HPIP)in erythroid differentiation[J].Biol Chem,2012,287(8):5600-5614.

[7]Wang X,Yang Z,Zhang H,et al.The estrogen receptor inter?acting protein HPIP increases estrogen-responsive gene expres?sion through activation of MAPK and AKT[J].Biochim Bio?phys Acta,2008,17(6):1220-1228.

[8]Ferguson A T,Davidson N E.Regulation of estrogen receptor α function in breast cancer[J].Crit Rev Oncog,1997,8(1):29-46.

[9]Klinge C M.Estrogen receptor interaction with co-activators and corepressors[J].Steroids,2000,65(5):227-251.

[10]Saji S,Jensen E V,Nilsson S,et al.Estrogen receptors α and β in the rodent mammary gland[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(1):337-342.

[11]Persad S,Attwell S,Gray V,et al.Regulation of protein ki?nase B/Akt—serine 473 phosphorylation by integrin-linked ki?nase:critical roles for kinase activity and amino acids argi?nine 211 and serineg 343[J].JBiolChem,2001,276(29):27462-27469.

[12]K?bel M,Pohl G,Schmitt WD,et al.Activation of mitogenactivated protein kinase is required for migration and inva?sion ofplacentalsitetrophoblastic tumor[J].Am JPathol,2005,167(3):879-885.

[13]Obata T,Brown G E,Yaffe M B,et al.MAP kinase path?waysactivated by stress:the p38 MAPK pathway[J].Crit Care Med,2000,28(4 Suppl):N67-77.