PES1蛋白與雄激素受體的相互作用及定位

關(guān)鑫，王洪遠，任偉，杜佩云，秘曉林，程龍，葉棋濃

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.大連醫(yī)科大學(xué) 腫瘤干細胞研究院，遼寧 大連 116000；3.安徽醫(yī)科大學(xué) 附屬安慶市立醫(yī)院口腔科，安徽 安慶 246600；4.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002

雄激素受體（androgen receptor，AR）屬于核受體超家族，是一種配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子[1]，包含4個結(jié)構(gòu)域，即N端的調(diào)控結(jié)構(gòu)域（NTD）、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）、鉸鏈區(qū)（H）及配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD）[2]。NTD結(jié)構(gòu)域又稱為轉(zhuǎn)錄激活域，它包含一個重要的激活區(qū)域 AF1（activation function 1），當人工刪減LBD區(qū)域后，AF1可通過配體不依賴的方式發(fā)揮作用。LBD結(jié)構(gòu)域包含一個配體依賴的激活區(qū)域AF2，其突變或缺失會明顯降低AR的轉(zhuǎn)錄活性[3]。當AR與雄激素結(jié)合后，會發(fā)生構(gòu)象變化而與熱激蛋白HSP90分離。此時AR將以二聚體的形式入核，并與基因中的特定序列——雄激素應(yīng)答元件（andro?gen response element，ARE）結(jié)合，進而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[4]。

AR在大多數(shù)組織中均有不同程度的表達。無論在正常發(fā)育中還是病理狀態(tài)下，AR都發(fā)揮重要的作用。目前，AR已成為前列腺癌的治療靶標[5]。此外，有研究表明AR在很多乳腺癌患者中高表達，且可能成為治療ER-/HER2+乳腺癌患者的新靶標[6-9]。

人PES1蛋白由588個氨基酸殘基（aa）組成，除包含多個核定位信號和一個小泛素化樣修飾蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）位點外，在311～415 aa區(qū)域存在典型的 BRCT 結(jié)構(gòu)域[10-12]。PES1主要定位于核中，具有DNA結(jié)合能力。低等真核生物、鼠或人PES1在正常胚胎發(fā)育、核糖體生物發(fā)生、DNA復(fù)制、染色體穩(wěn)定性和細胞周期調(diào)控中起重要作用[13-16]。

PES1在許多腫瘤，如乳腺癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌及胃癌等中表達水平上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)，在雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性的乳腺癌中，PES1通過調(diào)節(jié)ERα和ERβ的平衡來影響乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展[17]。也有研究表明，在ER陰性的乳腺癌細胞中，PES1仍能促進細胞生長，發(fā)揮癌基因的作用，提示在乳腺癌中，PES1還有不依賴于ER的作用方式[18]，但這種作用方式尚不明確。AR和ER有著相似的結(jié)構(gòu)，AR能夠調(diào)節(jié)ERα陽性和ERα陰性乳腺癌細胞的生長，因此我們檢測了PES1是否能夠與AR相互作用，調(diào)節(jié)AR的表達水平。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，PES1能夠與AR相互作用，PES1不調(diào)節(jié)AR的表達水平，這為研究PES1對乳腺癌中AR功能的調(diào)節(jié)提供了重要線索。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎293T細胞由本實驗室保存；乳腺癌ZR75-1敲低PES1穩(wěn)定克隆細胞系由本實驗室構(gòu)建；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000購自Invitrogen公司；質(zhì)粒Flag-PES1、Flag-PES1（1-110）、Flag-PES1（111-220）、Flag-PES1（221-322）、Flag-PES1（311-588）、Flag-PES1（415-588）均由本實驗室構(gòu)建；質(zhì)粒MYC-AR、MYC-AR（1-568）、MYC-AR（484-651）、MYC-AR（484-918）由周建光研究員實驗室贈送；Flag-HRP、MYC-HRP抗體購自Sigma公司；兔抗人GAPDH抗體和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG均購自Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

293T細胞和ZR75-1細胞用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在CO2含量為5%的37℃孵箱中培養(yǎng)，細胞長滿時用胰酶消化傳代。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時嚴格按照說明書中轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的量進行操作，轉(zhuǎn)染4～6 h后更換新鮮的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24 h后收細胞。

1.3 Western印跡及免疫共沉淀

1.3.1 Western印跡 收細胞后加入SDS加樣緩沖液，煮沸15 min，離心后取上清液進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉1∶5000稀釋的MYC抗體或1∶10 000稀釋的GAPDH抗體，室溫輕搖1 h，用TBST洗膜3次，每次7 min，加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG，室溫輕搖1 h，用TBST洗膜3次，每次7 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.3.2 免疫共沉淀 收集細胞后加入裂解液于冰上裂解30 min，用注射器反復(fù)吹打至染色質(zhì)斷裂，離心去上清，加入偶聯(lián)抗體的瓊脂糖珠，4℃結(jié)合4 h至過夜，用裂解液洗滌沉淀物3次，每次10 min，在洗滌后的瓊脂糖珠中加入SDS上樣緩沖液進行Western印跡分析，用另一種抗體檢測2種蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。

2 結(jié)果

2.1 PES1蛋白與AR的相互作用

將帶有FLAG標簽的PES1表達質(zhì)粒和帶有MYC標簽的AR表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，24 h后收細胞，用抗FLAG瓊脂糖珠進行免疫共沉淀，用FLAG和MYC抗體進行Western印跡檢測。結(jié)果表明，帶有MYC標簽的AR只在含有FLAG PES1的免疫共沉淀產(chǎn)物中被檢測出來（圖1），即AR能夠特異地與PES1蛋白結(jié)合。

2.2 PES1與AR的相互作用定位

圖1 免疫共沉淀檢測PES1與AR的相互作用

圖2 帶FLAG標簽的PES1截短突變體示意圖

為了確定PES1與AR相互作用的區(qū)域，首先構(gòu)建了帶有FLAG標簽的PES1不同區(qū)域的表達載體（圖2），將這些載體和MYC-AR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，用上述方法進行免疫共沉淀之后用Western印跡檢測。結(jié)果表明，PES11-110、PES1111-220、PES1221-322、和PES1311-588均能與AR相互結(jié)合，而PES1415-588不能結(jié)合（圖3）。此外，將FLAG-PES1質(zhì)粒與帶MYC標簽的AR不同區(qū)域的表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞進行免疫共沉淀后發(fā)現(xiàn)，PES1與AR484-918能夠結(jié)合，而與AR1-568、AR484-651不結(jié)合（圖 4），說明 PES1結(jié)合在AR651-918區(qū)域。

2.3 PES1不調(diào)節(jié)AR水平

我們以前的研究發(fā)現(xiàn)PES1能和ER結(jié)合，并調(diào)節(jié)ER的蛋白表達水平。因此，我們檢測了PES1是否能夠調(diào)節(jié)AR的蛋白表達水平。在ZR75-1細胞中轉(zhuǎn)染PES1 siRNA，48 h后收集細胞，用Western印跡檢測PES1和AR的表達水平，發(fā)現(xiàn)敲低PES1后AR的蛋白水平?jīng)]有發(fā)生變化（圖5）。

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PES1能夠與AR相互作用，PES1的多個區(qū)域能與AR結(jié)合，且主要結(jié)合在AR的AF2結(jié)構(gòu)域，PES1不能調(diào)節(jié)AR的表達水平。

PES1的截短突變體中，除PES1415-588外的區(qū)域均能與AR結(jié)合，提示PES11-110、PES1111-220、PES1221-322和PES1311-588內(nèi)均含有與AR直接或間接結(jié)合的區(qū)域。PES1能夠與AR的AF2區(qū)域結(jié)合，而AF2區(qū)域是配體依賴的轉(zhuǎn)錄激活域，提示PES1可能作為AR的共調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)AR的轉(zhuǎn)錄活性和功能，這需要進一步通過實驗驗證。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)PES1能與ERα、ERβ相互作用，通過抑制泛素化連接酶CHIP與ERα的結(jié)合升高ERα的表達水平，通過促進CHIP與ERβ的結(jié)合下調(diào)ERβ的表達水平。CHIP也是AR的泛素化連接酶，能夠介導(dǎo)AR通過泛素-蛋白酶體途徑降解。因此，我們檢測了PES1是否能夠調(diào)節(jié)AR的表達水平，證實PES1不能調(diào)節(jié)AR的蛋白表達水平，提示PES1可能不能調(diào)節(jié)CHIP介導(dǎo)的AR蛋白降解。

圖3 免疫共沉淀檢測PES1突變體與AR的相互作用

圖4 免疫共沉淀檢測PES1與AR突變體的相互作用

圖5 Western印跡檢測ZR75-1細胞中PES1對AR的影響

乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制復(fù)雜，眾多調(diào)節(jié)因子參與了這一過程。有研究表明，AR在ERα陽性細胞中通過抑制ERα的活性而抑制細胞生長，在ERα陰性細胞中則促進細胞生長。目前關(guān)于AR在乳腺癌中的功能及其調(diào)節(jié)因子和機制的研究較少，本實驗發(fā)現(xiàn)了一個新的AR相互作用蛋白PES1，PES1可能通過調(diào)節(jié)AR的活性調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的增殖。

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