炭疽芽胞桿菌mntA基因缺失突變株的構(gòu)建及鑒定

刁立鵬，王艷春，萬(wàn)秀坤，陶好霞，袁盛凌，楊百亮，劉純杰

1.天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，病原微生物與生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

炭疽芽胞桿菌引起的炭疽是一種自然疫源性疾病和人畜共患急性傳染病，多發(fā)于牧區(qū)，在我國(guó)被列為乙類傳染病。炭疽桿菌芽胞可以氣溶膠的形式傳播。炭疽呈全球性分布，在溫帶、衛(wèi)生條件差的地區(qū)多發(fā)。動(dòng)物主要由于攝入染菌野草和飼料或吸入染塵而感染發(fā)病。炭疽桿菌因其毒力強(qiáng)、危害大、芽胞存活時(shí)間長(zhǎng)而成為潛在的生物武器[1]。

目前防治炭疽主要通過(guò)預(yù)防接種。我國(guó)和俄羅斯主要使用活芽胞苗，不加任何防腐劑和殺菌劑，為一次性接種。我國(guó)用的是A16R菌株，此菌株不含pXO2大質(zhì)粒，不能形成莢膜，因此毒力大大減弱，通過(guò)皮膚劃痕進(jìn)行免疫接種，以活芽胞進(jìn)入體內(nèi)活菌數(shù)的多少作為免疫強(qiáng)弱的依據(jù)，它們?cè)谶M(jìn)入體內(nèi)后還能夠繁殖[2-3]。美國(guó)使用鋁膠疫苗（AVA），是一種經(jīng)氫氧化鋁吸附和福爾馬林處理的炭疽桿菌V770-NPI-R株的上清濾液，該菌株為產(chǎn)毒素、無(wú)莢膜、非蛋白酶解性炭疽桿菌[4]。上述2種疫苗均屬于第一代炭疽疫苗，它們均存在一定的缺點(diǎn)。因此，研究新型炭疽疫苗具有重要意義。

目前炭疽疫苗研究的主要方向有兩個(gè)，一是以減毒炭疽桿菌表達(dá)的保護(hù)性抗原（PA）rPA102或大腸桿菌表達(dá)的rPA結(jié)合適當(dāng)佐劑作為疫苗，免疫方式為注射免疫；二是構(gòu)建表達(dá)PA的活載體疫苗，如減毒炭疽桿菌[4]、枯草芽胞桿菌[5]、乳酸桿菌[6-7]、減毒沙門菌、減毒痘病毒載體等?；罹d體疫苗的優(yōu)勢(shì)在于其免疫后能夠激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且便于大量生產(chǎn)。

炭疽芽胞桿菌mntA基因與菌株的生長(zhǎng)密切相關(guān)，它編碼的MntA蛋白是一種可溶的ATP依賴的結(jié)合錳離子的轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白，在體外培養(yǎng)和感染宿主的過(guò)程中都能表達(dá)，且MntA蛋白的表達(dá)不依賴于毒性質(zhì)粒pXO1和pXO2。研究表明，mntA缺失突變會(huì)導(dǎo)致菌株毒力減弱，是一個(gè)新型炭疽毒力因子。因此，mntA缺失株有可能成為弱毒苗的候選株[8]。

本實(shí)驗(yàn)室已從我國(guó)現(xiàn)有疫苗株A16R（pXO1+pXO2-）制得AP422（pXO1-pXO2-），但進(jìn)行豚鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)毒力仍較強(qiáng)。因此，我們擬對(duì)AP422株進(jìn)一步減毒，敲除mntA基因，以便用于后續(xù)炭疽疫苗研究。

1 材料和方法

1.1 材料

炭疽桿菌AP422和質(zhì)粒pMAD-spc、pHY-Cre均由本室保存；大腸桿菌SCS110感受態(tài)細(xì)胞為本室自制；大腸桿菌DH5α購(gòu)自全式金公司；各種限制性內(nèi)切酶為Thermo公司產(chǎn)品；DNA markerⅢ、1 kb lad?der購(gòu)自中科瑞泰公司；T載體、pfu DNA聚合酶及其他PCR相關(guān)試劑和HRP顯色試劑盒為TIANGEN生物產(chǎn)品；其他分子生物學(xué)試劑分別購(gòu)自Promega、Ta?KaRa等公司；兔抗MntA的多抗血清為本實(shí)驗(yàn)室自制；HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG抗體購(gòu)自中杉金橋公司；PCR引物設(shè)計(jì)和序列測(cè)定由生物工程研究所中心儀器實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 打靶載體的構(gòu)建

以AP422株基因組為模板設(shè)計(jì)引物。上游同源臂的上游引物為 uMntAF（5′-CGGGATCCGAACCA ACTGTTATGTC-3′），下游引物為 uMntAR（5′-ACG CGTCGACTTTTATCCTCCAATCA-3′）；下游同源臂的上游引物為 dMntAF（5′-CGACGCGTAATCTAGC TTGTGTAACTG-3′），下游引物為 dMntAR（5′-CGG AATTCCTGCTGCATAGTGAAG-3′）。PCR 條 件 ：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，45℃退火30 s，72℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；將退火溫度改為54℃，其他條件不變，25個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸5 min。

用pfu DNA聚合酶擴(kuò)增出mntA基因上下游各約800 bp的片段，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切上游同源臂和pMAD-spc質(zhì)粒，在22℃條件下連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，取連接正確的質(zhì)粒測(cè)序；用MluⅠ和EcoRⅠ雙酶切測(cè)序正確的質(zhì)粒和下游同源臂后，與pMAD-spc質(zhì)粒在22℃條件下連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，取連接正確的質(zhì)粒測(cè)序。

1.3 mntA基因的敲除

活化培養(yǎng)AP422菌株，當(dāng)D600nm值達(dá)0.5～0.6（約需2 h）時(shí)制備感受態(tài)細(xì)胞[9-11]；將質(zhì)粒用Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，30℃孵育2.5 h，涂布于含壯觀霉素（Spc）（300 μg/mL）的LB平板上，30℃過(guò)夜培養(yǎng)。

挑取克隆，42℃無(wú)抗傳代，傳5、6代后梯度稀釋，分別涂在3塊含Spc（300 μg/mL）和3塊含紅霉素（Em）（5 μg/mL）的LB平板上，將Spc平板于42℃培養(yǎng)，Em平板于30℃培養(yǎng)；當(dāng)Em抗性平板上菌落生長(zhǎng)較少時(shí)，從Spc抗性平板上挑取單菌落做點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)，同時(shí)點(diǎn)在Em抗性平板和Spc抗性平板上；挑取在Em抗性平板上不生長(zhǎng)且在Spc抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)[12]。

同前電擊轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pHY-Cre，30℃孵育2.5 h，將得到的重組菌在含Em（5 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中于30℃下傳2代，在無(wú)抗條件下于37℃?zhèn)?代；在不含抗生素的平板上劃線分離單菌落，然后進(jìn)行抗生素抗性分析[13]。

1.4 重組菌的鑒定

1.4.1 PCR 以AP422和AP422ΔmntA菌株的基因組為模板，PCR擴(kuò)增上下游同源臂的一部分和它們之間的基因。上游引物為5′-CTGTTGGAATTATT CTAGTTGTTGC-3′，下游引物為 5′-GGTAATGGGA TTTGGGAAGGTGATG-3′。PCR條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，72℃充分延伸5 min。

1.4.2 Western印跡 對(duì)經(jīng)PCR鑒定在基因水平發(fā)生重組的菌株制備全菌蛋白裂解液，用12%凝膠進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，膜用5%脫脂奶粉于37℃封閉1 h，與抗MntA的多抗血清（1∶20 000）于37℃共孵育1 h，用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，再與HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG抗體（1∶5000）共孵育1 h，用PBST洗滌3次，每次5 min，最后將膜洗干凈后用HRP顯色試劑盒進(jìn)行顯色[14]。

1.5 突變株特性分析

1.5.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將AP422和AP422ΔmntA菌株分別接種于5 mL腦心浸液（BHIG）液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h左右，取菌液100 μL接種于100 mL BHIG培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)，每1 h測(cè)定一次D600nm值，以測(cè)定時(shí)間為橫坐標(biāo)、D600nm值為縱坐標(biāo)，繪制被測(cè)菌在實(shí)驗(yàn)條件下的生長(zhǎng)曲線。

1.5.2 芽胞形成能力分析 取2種菌的單克隆接種到5 mL BHIG培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，取1 mL菌液，離心收集菌體，轉(zhuǎn)接到裝有5 mL預(yù)熱到37℃的LB培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)96 h以上，期間觀察培養(yǎng)物的生長(zhǎng)狀態(tài)和芽胞形成情況。

1.5.3 2種菌生存能力的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn) 將AP422和AP422ΔmntA::spc分別接種于5 mL BHIG培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)物按1%的比例接種到5 mL新的BHIG培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，各取500 μL菌液混合，取5 μL混合菌液接種到5 mL BHIG培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h；同時(shí)取100 μL混合菌液梯度稀釋，各取100 μL涂布無(wú)抗平板和Spc抗性平板，于37℃培養(yǎng)16 h后計(jì)數(shù)菌落。在此基礎(chǔ)上，按上述條件傳代3次以上，按同樣方法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 基因敲除載體的構(gòu)建

以炭疽芽胞桿菌AP422的基因組為模板，用相應(yīng)引物擴(kuò)增基因打靶上下游同源臂（經(jīng)測(cè)序鑒定正確），然后將上下游同源臂依次連接到質(zhì)粒pMAD-spc上，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，質(zhì)粒凝膠電泳表明重組質(zhì)粒能切出約3 kb的目標(biāo)條帶（圖1）。

2.2 mntA基因的敲除

將構(gòu)建的打靶載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌SCS110，提取質(zhì)粒后再轉(zhuǎn)化炭疽桿菌AP422，通過(guò)一系列篩選得到帶有Spc抗性標(biāo)記的mntA基因缺失的重組菌AP422ΔmntA::spc，然后轉(zhuǎn)入Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒pHY-cre，Cre重組酶識(shí)別34 bp的部分反轉(zhuǎn)重復(fù)的LoxP序列（ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACG AAGTTAT），通過(guò)分子內(nèi)重組去掉spc抗性基因[15]，最終獲得目的菌株AP422ΔmntA。

2.3 重組菌的鑒定

PCR結(jié)果見(jiàn)圖2，AP422的擴(kuò)增結(jié)果約為1500 bp，AP422ΔmntA的擴(kuò)增結(jié)果約為500 bp，兩者相差1000 bp，和mntA基因片段大小基本吻合，說(shuō)明AP422的mntA基因已被敲除。將重組菌擴(kuò)增得到的片段連接到T載體后測(cè)序，結(jié)果顯示mntA基因已完全缺失，相應(yīng)位點(diǎn)處只剩下一個(gè)LoxP位點(diǎn)，這就在基因水平上證實(shí)了mntA基因敲除成功。

炭疽芽胞桿菌為革蘭陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁致密，經(jīng)超聲波破碎后，MntA蛋白可充分釋放。MntA蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為35×103。以MntA蛋白抗血清為一抗的Western印跡結(jié)果如圖3，AP422在35×103處有明顯條帶，說(shuō)明有MntA蛋白表達(dá)，而AP422ΔmntA則無(wú)MntA蛋白表達(dá)，這就從蛋白水平上說(shuō)明mntA基因被成功敲除。

2.4 生長(zhǎng)特性鑒定結(jié)果

2.4.1 生長(zhǎng)曲線 如圖4，在本實(shí)驗(yàn)條件下，AP422的生長(zhǎng)速度比AP422ΔmntA稍快，但區(qū)別不明顯。

2.4.2 芽胞形成 將培養(yǎng)96 h的重組菌株進(jìn)行芽胞染色（圖5）。在實(shí)驗(yàn)條件下，突變株AP422ΔmntA形成芽胞的能力與對(duì)照AP422株基本一致，說(shuō)明敲除mntA基因后沒(méi)有影響菌株形成芽胞的能力，重組菌的這一特質(zhì)也為后續(xù)研究芽胞疫苗載體打下了很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果

圖2 mntA敲除鑒定的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 重組菌的Western印跡鑒定結(jié)果

圖4 菌株AP422和AP422ΔmntA的生長(zhǎng)曲線

2.4.3 生長(zhǎng)能力 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在Spc抗性平板上生長(zhǎng)的菌落為AP422ΔmntA::spc，在無(wú)抗平板上生長(zhǎng)的菌落為AP422ΔmntA::spc和AP422。無(wú)抗平板上的菌落數(shù)減去Spc抗性平板上的菌落數(shù)，即為AP422的菌落數(shù)。計(jì)算得出2種菌共培養(yǎng)之前的比例為1.30，培養(yǎng)到第1代時(shí)的比例為0.79，第2代時(shí)為0.05，第3代時(shí)為0.00003，培養(yǎng)到第4代時(shí)Spc抗性平板上基本沒(méi)有菌落（圖6）。這充分說(shuō)明在體外培養(yǎng)條件下，AP422ΔmntA::spc的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力要比AP422弱，這也在一個(gè)側(cè)面表明mntA基因的突變使菌株的生存能力降低。。

圖5 菌株AP422和AP422ΔmntA的芽胞形成情況

圖6 菌株AP422和AP422ΔmntA共培養(yǎng)條件下的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)

3 討論

MntA蛋白是一種新型毒力因子，是可溶性的能與錳離子結(jié)合的脂蛋白，它是Lral/clusterⅨ家族的離子受體。炭疽桿菌mntA基因位于3個(gè)基因操縱子內(nèi)，編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)受體。蛋白表達(dá)分析證實(shí)MntA蛋白在體內(nèi)外均可表達(dá)。不像其他編碼毒素的基因，mntA的表達(dá)不依賴于毒性質(zhì)粒pXO1和pXO2。

在炭疽的致病機(jī)理中，炭疽芽胞桿菌的芽胞和宿主的吞噬細(xì)胞之間的相互作用是感染過(guò)程中很重要的一步。炭疽致病由宿主的吞噬細(xì)胞吸入炭疽芽胞開(kāi)始，芽胞的發(fā)育和毒素的表達(dá)都在細(xì)胞中進(jìn)行，最后炭疽芽胞桿菌裂解吞噬細(xì)胞，將繁殖體釋放到細(xì)胞體外。研究發(fā)現(xiàn)[8]，在RAW264.7吞噬細(xì)胞系模型中，mntA突變株的生長(zhǎng)和裂解吞噬細(xì)胞的速度變慢，這種缺陷可通過(guò)在培養(yǎng)基中加入適宜濃度的錳離子或通過(guò)mntA互補(bǔ)來(lái)恢復(fù)。

另有研究表明[8]，以豚鼠為動(dòng)物模型，采用皮下注射的方式進(jìn)行攻毒時(shí)，由炭疽芽胞桿菌Vollum株得到的mntA基因的缺失突變株較野生株的LD50從102提高到了8×105，提高幅度接近4個(gè)數(shù)量級(jí)，其毒力大大降低。這些結(jié)果都提示我們，mntA基因的缺失突變株可用于構(gòu)建新型的減毒活芽胞疫苗。我們的結(jié)果也表明，mntA基因的缺失突變株與原始出發(fā)菌株共培養(yǎng)時(shí)其生長(zhǎng)明顯處于劣勢(shì)，說(shuō)明突變使菌株變得更安全，有望在研究新一代活芽胞疫苗中發(fā)揮重要作用。

[1]Hanna P.Anthrax pathogenesis and host response[M]∥Vogt P K,Mahan M J.Bacterial infection:close encounters at the host pathogen interface.Springer Berlin Heidelberg,1998:13-35.

[2]董樹(shù)林.炭疽菌苗免疫述評(píng)[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,1994,22(2):39.

[3]王秉翔.炭疽疫苗當(dāng)代新疫苗[M].北京:高等教育出版社,2001:423-438.

[4]Skoble J,Beaber J W,Gao Y,et al.Killed but metabolically active Bacillus anthracis vaccines induce broad and protective immunity against anthrax[J].Infect Immun,2009,77(4):1649-1663.

[5]Stokes M G M,Titball R W,Neeson B N,et al.Oral admin?istration of a Salmonella enterica-based vaccine expressing Ba?cillusanthracisprotectiveantigen confersprotection against aerosolized B.anthracis[J].InfectImmun,2007,75(4):1827-1834.

[6]Scorpio A,Blank T,Day W,et al.Biological weapons:an?thrax vaccines:Pasteur to the present[J].Cell Mol Life Sci,2006,63(19-20):19-20.

[7]Cote C K,Rossi C A,Kang A S,et al.The detection of pro?tective antigen(PA)associated with spores of Bacillus anthra?cis and the effects of anti-PA antibodies on spore germina?tion and macrophage interactions[J].Microb Pathog,2005,38(5):209-225.

[8]Gat O,Mendelson I,Chitlaru T,et al.The solute-binding component of a putative Mn(II)ABC transporter(MntA)is a novel Bacillus anthracis virulence determinant[J].Mol Microbi?ol,2005,58(2):533-551.

[9]Pomerantsev A P,Sitaraman R,Galloway C R,et al.Genome engineering in Bacillus anthracis using Cre recombinase[J].In?fect Immun,2006,74(1):682-693.

[10]Shatalin K Y,Neyfakh A A.Efficient gene inactivation in Ba?cillus anthracis[J].FEMS Microbiol Lett,2005,245(2):315-319.

[11]Brunsing R L,La Clair C,Tang S,et al.Characterization of sporulation histidine kinases of Bacillus anthracis[J].J Bacteri?ol,2005,187(20):6972-6981.

[12]王艷春.炭疽桿菌芽孢疫苗載體的探索性研究[D].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2009.

[13]王艷春,姜娜,展德文,等.Cre-LoxP系統(tǒng)在炭疽芽胞桿菌基因敲除中的應(yīng)用及eag基因的敲除[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2009,36(7):934-940.

[14]陳雪嵐.基因工程實(shí)驗(yàn)[M].北京:科學(xué)出版社,2012.

[15]Le Y,Sauer B.Conditional gene knockout using Cre recombi?nase[J].Mol Biotechnol,2001,17(3):269-275.