利用優(yōu)化的5′-RACE實(shí)驗(yàn)定位副溶血弧菌基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

李杰，張義全，高鶴，王麗，胡小許 ，周冬生

1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

基因是遺傳物質(zhì)的最小功能單位，它通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯而對(duì)生物體表型產(chǎn)生專(zhuān)一性效應(yīng)。轉(zhuǎn)錄是DNA指導(dǎo)下的RNA合成過(guò)程，起始于DNA模板的一個(gè)特定起點(diǎn)，即基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。對(duì)原核生物而言，其mRNA 5′端的堿基即為其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

在前期研究中[1-5]，我們通常采用引物延伸實(shí)驗(yàn)來(lái)確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。但引物延伸實(shí)驗(yàn)需要利用放射性核素對(duì)特異性引物的5′端進(jìn)行標(biāo)記，這不僅極易產(chǎn)生放射性廢物污染，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)者的健康也有較大傷害。因此，該方法并不是尋找基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的最優(yōu)選擇。5′-cDNA末端快速擴(kuò)增（5′-rapid-amplification of cDNA ends，5′-RACE）實(shí)驗(yàn)也可以用來(lái)確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，該方法通過(guò)在mRNA的5′端連接接頭（Adapter），而后聯(lián)合利用逆轉(zhuǎn)錄、巢式PCR和DNA測(cè)序技術(shù)，即可最終確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，具有靈敏度高和特異性好的優(yōu)點(diǎn)。然而，目前市售5′-RACE試劑盒均是針對(duì)真核生物mRNA的帽子結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)的。由于細(xì)菌的mRNA無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，市售試劑盒并不能直接應(yīng)用于原核生物。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP菌）是一種廣泛分布于淺海海域及海產(chǎn)品中的革蘭陰性弧菌，也是引起食物中毒的首要病原菌，能引起以腹瀉為主要癥狀的急性胃腸炎[6]。VP菌具有多種毒力因子，主要包括Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS1和T3SS2）、直接耐熱溶血素（TDH）和TDH相關(guān)溶血素（TRH）。ToxR（VP0820編碼）是VP菌的毒力轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，能調(diào)節(jié)TDH和T3SS1相關(guān)基因的表達(dá)[7-8]。VP菌具有很強(qiáng)的生物膜形成能力，以抵抗不利的生存環(huán)境。作為第二信使，c-di-GMP能促進(jìn)生物膜的形成。VP菌有數(shù)十個(gè)蛋白參與c-di-GMP的分子代謝，包括ScrC[9]、ScrG[10]及 VPA0198。ScrC 由操縱子 scrABC編碼，主要具有磷酸二酯酶活性，能降解c-di-GMP，抑制胞外多糖CPS（cps操縱子編碼，cpsA是其首基因）的合成，從而抑制生物膜的形成[9，11]；ScrG也主要表現(xiàn)為磷酸二酯酶活性，參與降解c-di-GMP[10]；VPA0198在c-di-GMP代謝中的功能還不是很清楚，可能主要參與c-di-GMP的合成。VP菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)2（T6SS2）基因位點(diǎn)包含3個(gè)操縱子，分別為VPA1027-1024、VPA1043-1028和VPA1044-1046，該系統(tǒng)是其主要的黏附因子之一[12]。

在本研究中，我們以VP菌VP0820、VPA1027、scrC、scrG、cpsA及VPA0198為研究對(duì)象，在Ambion公司FirstChoice RLM-RACE試劑盒基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，摸索出一個(gè)適用于原核生物的5′-RACE實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料和方法

1.1 材料

VP 菌 RIMD2210633（tdh+，KP+）和大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；HI肉湯培養(yǎng)基（2.5%Difco Heart Infusion Broth）購(gòu)自BD公司；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物回收試劑盒為QIAGEN產(chǎn)品；DNA-free試劑盒和FirstChoice RLM-RACE試劑盒為Ambion公司產(chǎn)品；TRIzol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；pGEM-T Easy Vector SystemⅠ（T載體）、Primer Extension System、fmol DNA Cycle Sequencing System等為Promega公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)與RNA提取

取20 μL甘油菌種接種于15 mL HI肉湯培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)12～14 h（至平臺(tái)期），而后以1∶1000稀釋?zhuān)臃N至新鮮的15 mL HI肉湯中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至D600nm約為1.0，收集菌體，用TRIzol試劑[1]提取細(xì)菌總RNA，總RNA質(zhì)量用1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)測(cè)。

1.3 消化DNA

用DNA-free試劑盒去除總RNA中的DNA，50 μL 實(shí)驗(yàn)體系包括 5 μL 10×DNaseⅠ緩沖液、2.5 μL rDNaseⅠ、6～8 μg總RNA、1 μL RNase抑制劑，用無(wú)核酸酶水補(bǔ)足。37℃孵育30 min后，加入100 μL無(wú)核酸酶水和150 μL酚∶氯仿（1∶1），充分混勻，室溫12 000 r/min離心5 min，將上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入150 μL氯仿，充分混勻，離心后取上層水相，加入150 μL異丙醇，充分混勻，12 000 r/min離心20 min，RNA沉淀用0.5 mL 70%乙醇漂洗1次，最后用10 μL無(wú)核酸酶水溶解。

1.4 Adapter的連接

將已知序列的寡核苷酸片段（Adapter）連接至RNA的5′端，反應(yīng)體系包括4 μL總RNA、1 μL 5′-RACE Adapter、1 μL 10×RNA 連接酶緩沖液、2 μL T4RNA連接酶（2.5 U/μL），補(bǔ)加無(wú)核酸酶水至10 μL。溫和混勻，37℃孵育1 h后，直接用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

將連接有Adapter的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系包括 2 μL 上述經(jīng)處理的總 RNA、4 μL dNTP、2 μL 隨機(jī)十聚體（random decamers）、2 μL 10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、1 μL RNase抑制劑、1 μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，補(bǔ)加無(wú)核酸酶水至20 μL。輕輕混勻，42℃孵育1 h。cDNA產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)。此步應(yīng)有不加逆轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照。

1.6 巢式PCR反應(yīng)

采用巢式PCR方法擴(kuò)增目的基因。第一輪PCR體系包括0.5 μL cDNA模板、2.5 μL 10×PCR緩沖液、2 μL dNTP、10 μmol/L基因特異性外引物和位于Adpater上的外引物（表1）各1 μL、0.75 U DNA聚合酶，補(bǔ)加去離子水至25 μL。第二輪PCR體系包括0.5 μL第一輪PCR產(chǎn)物（無(wú)須純化回收）、5 μL 10×PCR緩沖液、4 μL dNTP、10 μmol/L基因特異性?xún)?nèi)引物和位于Adpater上的內(nèi)引物（表1）各2 μL、1.25 U DNA聚合酶，補(bǔ)加去離子水至50 μL。PCR 反應(yīng)程序均為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃50 s，72℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。第二輪產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收后待用。

1.7 PCR產(chǎn)物連接至T載體

將回收的第二輪PCR產(chǎn)物直接連接至T載體，連接體系包括 100～200 ng DNA 片段、1 μL T載體、5 μL 2×DNA連接酶緩沖液、1 μL T4DNA連接酶（2.5 U/μL），補(bǔ)加去離子水至10 μL。輕微混勻后，置10℃連接4 h以上。采用熱沖擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，并用氨芐西林（100 μg/mL）抗性平板篩選抗性克隆，PCR鑒定（鑒定引物對(duì)同第二輪PCR）陽(yáng)性者測(cè)序。

1.8 引物延伸實(shí)驗(yàn)

將與VPA1027 mRNA互補(bǔ)的特異性引物（表1）的5′端用［γ-32P］ATP（5000 Ci/mmol）進(jìn)行放射性標(biāo)記[13]，并將其退火到mRNA上，進(jìn)而將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配伍測(cè)序條帶進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影后，通過(guò)引物延伸條帶的位置即可確定VPA1027轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 cDNA中無(wú)基因組DNA污染

總RNA用50 μL無(wú)核酸酶水溶解后，其濃度應(yīng)在1000 ng/μL以上，且經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無(wú)降解后，方可滿(mǎn)足下一步實(shí)驗(yàn)需要?？俁NA經(jīng)DNA-free試劑盒消化及連接Adapter后，直接逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，而后通過(guò)RT-PCR方法驗(yàn)證cDNA中是否有DNA污染，結(jié)果見(jiàn)圖1，以cDNA+和基因組DNA為模板時(shí)，均能擴(kuò)增出同理論值大小一致的產(chǎn)物（231 bp），而以cDNA-和水為模板時(shí)，均不能擴(kuò)增出條帶，這說(shuō)明cDNA中無(wú)基因組DNA污染，可用作5′-RACE實(shí)驗(yàn)的模板。

表1 本研究所用引物序列

2.2 靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

采用巢式PCR擴(kuò)增目的基因片段，如圖2A所示，VPA1027、scrA、scrG、cpsA和VPA0198均擴(kuò)增出明亮的產(chǎn)物條帶，但scrA條帶拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重。將上述PCR產(chǎn)物直接與T載體連接，篩選鑒定陽(yáng)性者送公司測(cè)序。圖2B～F分別為VPA1027、scrG、scrA、cpsA和VPA0198的測(cè)序結(jié)果，分別與標(biāo)準(zhǔn)序列（DNA）比對(duì)，并根據(jù)Adapter序列，可以得出它們的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別為G（-103）、G（-70）、T（-205）、C（-129）和G（-238）（翻譯起始位點(diǎn)為+1）。

2.3 引物延伸驗(yàn)證VPA1027的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

圖3為VPA1027的引物延伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出，若以翻譯起始位點(diǎn)為+1，則VPA1027的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為-103位的G，這與5′-RACE的結(jié)果一致，說(shuō)明5′-RACE得到的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是可靠的。

2.4 靶基因的啟動(dòng)子區(qū)序列

通過(guò)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)查詢(xún)基因的核心啟動(dòng)子區(qū)，可以反向驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的正確性。圖4為VPA1027、scrG、scrA、cpsA和VPA0198的啟動(dòng)子區(qū)序列?？梢钥闯觯瑂crG、cpsA和VPA0198均具有比較保守的-10（TATAAT）和-35（TTGACA）序列，這說(shuō)明了其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的可靠性；但VPA1027和scrA只有相對(duì)保守的-10序列，而-35序列保守性較差，這說(shuō)明在生理?xiàng)l件下，它們的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)可能需要反式激活因子的輔助才能完成。

3 討論

市售5′-RACE試劑盒是依據(jù)真核生物mRNA的帽子結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)的。無(wú)帽子結(jié)構(gòu)的DNA片段、rRNA及tRNA的5′端磷酸基團(tuán)極易被牛小腸堿性磷酸酶（calf intestine alkaline phosphatase，CIP）水解，而帶帽子結(jié)構(gòu)的mRNA則不受影響。但是，mRNA的帽子結(jié)構(gòu)能被煙草酸焦磷酸酶（tobacco acid py?rophosphatase，TAP）水解，并留下5′端磷酸基團(tuán)。因此，可以依次用CIP和TAP處理總RNA，再利用T4RNA連接酶將一個(gè)已知序列的寡核苷酸序列（Adapter）連接至mRNA的5′端磷酸基團(tuán)上，并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后通過(guò)巢式PCR和DNA測(cè)序的方法即可確定mRNA的5′末端。由于原核生物的mRNA的無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，市售5′-RACE試劑盒并不能直接應(yīng)用于原核生物mRNA的5′末端堿基的確定。我們?cè)贏mbion公司FirstChoice RLM-RACE試劑盒的基礎(chǔ)上，拋棄CIP和TAP處理總RNA的步驟，利用Ambion公司的DNA-free試劑盒去除總RNA中污染的DNA，而后直接將Adapter接頭連接至mRNA 5′末端，再將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后通過(guò)巢式PCR及測(cè)序的方法，成功定位了副溶血弧菌VPA1027、scrA、scrG、cpsA和VPA0198的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并通過(guò)引物延伸的方法驗(yàn)證了VPA1027的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。優(yōu)化后的方案不僅操作更簡(jiǎn)單，而且應(yīng)可適用于所有原核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)定位。

圖1 VP0820的RT-PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 第二輪PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖（A）及測(cè)序圖譜（B～F）

圖3 VPA1027的引物延伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 靶基因啟動(dòng)子區(qū)序列

引物延伸和5′-RACE實(shí)驗(yàn)是尋找基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的兩個(gè)常用方法，二者各有優(yōu)缺點(diǎn)。引物延伸實(shí)驗(yàn)是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程，其所得cDNA的量和mRNA的起始量成正比，因此它不僅可用來(lái)定位基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，還可用于研究調(diào)控子對(duì)靶基因的調(diào)控關(guān)系[1-5,14-16]。然而，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)搜尋的過(guò)程中，需要針對(duì)每個(gè)待研究的基因設(shè)計(jì)多條引物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)財(cái)、成功率低，且易產(chǎn)生放射性污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)者的健康也有損傷。5′-RACE實(shí)驗(yàn)雖然成功率高、避免了放射性同位素帶來(lái)的不便，但是它所得到的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)受mRNA降解片段的影響，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，而且也不能用于研究調(diào)控子對(duì)靶基因的調(diào)控關(guān)系。基于此，最合理的方法是將5′-RACE實(shí)驗(yàn)和引物延伸實(shí)驗(yàn)緊密結(jié)合起來(lái)，首先利用5′-RACE實(shí)驗(yàn)找出靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，再針對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，利用引物延伸實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，從而可以大大提高引物延伸實(shí)驗(yàn)的成功率。

[1]Zhang Y,Wang L,Han Y,et al.Autoregulation of PhoP/PhoQ and positive regulation of the cyclic AMP receptor pro?tein-cyclic AMP complex by PhoP in Yersinia pestis[J].J Bacteriol 2013,195(5):1022-1030.

[2]Zhang Y,Wang L,Fang N,et al.Reciprocal regulation of pH 6 antigen gene loci by PhoP and RovA in Yersinia pes?tis biovar Microtus[J].Future Microbiol,2013,8(2):271-280.

[3]Zhang Y,Qiu Y,Tan Y,et al.Transcriptional regulation of opaR,qrr2-4 and aphA by the master quorum-sensing regula?tor OpaR in Vibrio parahaemolyticus[J].PLoS One,2012,7(4):e34622.

[4]Sun F,Gao H,Zhang Y,et al.Fur is a repressor of biofilm formation in Yersinia pestis[J].PLoS One,2012,7(12):e52392.

[5]Zhang Y,Gao H,Wang L,et al.Molecular characterization of transcriptional regulation of rovA by PhoP and RovA in Yersinia pestis[J].PLoS One,2011,6(9):e25484.

[6]Yeung P S,Boor K J.Epidemiology,pathogenesis,and preven?tion of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections[J].Food?borne Pathog Dis,2004,1(2):74-88.

[7]Lin Z,Kumagai K,Baba K,et al.Vibrio parahaemolyticus has a homolog of the Vibrio cholerae toxRS operon that medi?ates environmentally induced regulation of the thermostable di?rect hemolysin gene[J].J Bacteriol,1993,175(12):3844-3855.

[8]Whitaker W B,Parent M A,Boyd A,et al.The Vibrio para?haemolyticus ToxRS regulator is required for stress tolerance and colonization in a novel orogastric streptomycin-induced adult murine model[J].Infect Immun,2012,80(5):1834-1845.

[9]Boles B R,McCarter L L.Vibrio parahaemolyticus scrABC,a novel operon affecting swarming and capsular polysaccharide regulation[J].J Bacteriol,2002,184(21):5946-5954.

[10]Kim Y K,McCarter L L.ScrG,a GGDEF-EAL protein,par?ticipates in regulating swarming and sticking in Vibrio para?haemolyticus[J].J Bacteriol,2007,189(11):4094-4107.

[11]Trimble M J,McCarter L L.Bis-(3'-5')-cyclic dimeric GMP-linked quorum sensing controls swarming in Vibrio parahaemo?lyticus[J].Proc NatlAcad SciUSA,2011,108(44):18079-18084.

[12]Yu Y,Yang H,Li J,et al.Putative type VI secretion sys?tems of Vibrio parahaemolyticus contribute to adhesion to cul?tured cellmonolayers[J].Arch Microbiol,2012,194(10):827-835.

[13]張義全,高鶴,王麗,等.鼠疫菌H-NS蛋白的表達(dá)與純化及其DNA結(jié)合活性分析[J].微生物學(xué)報(bào),2011,51(5):615-621.

[14]Sun F,Zhang Y,Wang L,et al.Molecular characterization of direct target genes and cis-acting consensus recognized by quorum-sensing regulator AphA in Vibrio parahaemolyticus[J].PLoS One,2012,7(9):e44210.

[15]Ma L,Zhang Y,Yan X,et al.Expression of the Type VI se?cretion system 1 component Hcp1 is indirectly repressed by OpaR in Vibrio parahaemolyticus[J].Scientific World J,2012,2012:982140.

[16]Qu S,Zhang Y,Liu L,et al.Cyclic AMP receptor protein is a repressor of adenylyl cyclase gene cyaA in Yersinia pestis[J].Can J Microbiol,2013,59(5):304-310.