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    HPLC法測定烏蕨中原兒茶酸及原兒茶醛的含量

    2014-10-27 05:10陳明段萍徐作剛萬紅才
    關(guān)鍵詞:原兒茶酸

    陳明+段萍+徐作剛+萬紅才

    基金項(xiàng)目:貴州省衛(wèi)生廳-黔南民族醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校科技聯(lián)合基金項(xiàng)目(gzwkj2013-2-006)。

    作者簡介:陳明(1965-),男,副教授,主要從事藥理學(xué)及藥物分析的研究。E-mail:462050602@qq.com

    通信作者:段萍(1964-),女,副主任藥師,主要從事化學(xué)藥及中成藥制劑分析的研究。E-mail:Duanping1964@163.com

    【摘 要】 目的:建立烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量測定方法。方法:采用HPLC法測定,色譜柱:迪馬Diamonsil ODS C18(4.6mm×150mm,5μm);Agilent ODS C18(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:0.4%磷酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫;流速:1.0ml/min,進(jìn)樣量:5μl;柱溫30℃;檢測波長:280nm。結(jié)果:原兒茶酸在0.16176-1.2132μg/ml內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,r=0.99996;平均回收率為96.70%,RSD為1.30%;原兒茶醛在0.06030-0.45225μg/ml內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,r=0.99996,平均回收率為96.18%,RSD為1.10%。結(jié)論:該方法測定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量,結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性、穩(wěn)定性好。

    【關(guān)鍵詞】 HPLC;烏蕨;原兒茶酸;原兒茶醛

    【中圖分類號】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517(2014)18-0011-02

    烏蕨Stenoloma chusanum(L.)Ching為鱗始蕨科烏蕨屬的多年生草本植物,別名烏韭、石發(fā)、土川連、孔雀尾、大葉金花草、小葉野雞尾、蜢蚱參、細(xì)葉鳳凰尾等,分布較為廣泛,是一種常見的中草藥。其具有一定的抗菌活性,有“萬能解毒藥”之稱[1-3]。烏蕨中含有葒草苷、葒草苷-2-O-B-D-吡喃葡萄糖苷、牡荊素、芹菜素、丁香酸、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸和龍膽酸等化合物。目前采用紫外分光光度法測定烏蕨中總黃酮、總酚酸含量[4-7]。未見報(bào)道測定原兒茶酸、原兒茶醛的含量。為此,本文采用HPLC法測定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器 島津LC-2010A高效液相色譜儀;Agilent1260高效液相色譜儀;島津2401紫外分光光度計(jì);SK250LHC超聲波清洗器(上海科導(dǎo)儀器有限公司);梅特勒AG135、AL204電子天平。

    1.2 試劑與材料 原兒茶酸(批號:0809-200604)、原兒茶醛(批號:110810-200506)對照品由中國藥品生物制品檢定所提供;乙腈(色譜純)、水為娃哈哈純凈水、其余試劑均為分析純。烏蕨樣本共7批,自然干燥10天后,地下部分洗凈,全草于90℃干燥5小時(shí),取地上部分、地下部分分別粉碎,過10目篩,即得供試樣品,見表1。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件[8-13] 色譜柱:迪馬Diamonsil ODS C18(4.6mm×150mm,5μm)、Agilent ODS C18(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:0.4%磷酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫, 0~20min,98%-92% A;20~35min,92%-98% A;35~40min,98% A;流速:1.0ml/min;進(jìn)樣量:5μl;柱溫:30℃;檢測波長:280nm。理論板數(shù)以原兒茶醛峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

    2.2 對照品溶液配制 精密稱取原兒茶酸、原兒茶醛對照品適量,加65%乙醇制成每1ml含原兒茶酸0.08mg、原兒茶醛0.03mg的溶液。

    2.3 供試品溶液配制[14、15] 取供試樣品約2.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入65%乙醇50ml,稱定重量,加熱回流60分鐘,放冷,再稱定重量,用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

    2.4 峰純度考察 取對照品溶液、供試品溶液各5μl,分別注入液相色譜儀,依法測定。結(jié)果表明:對照品原兒茶醛的紫外掃描圖在280nm處有最大吸收,原兒茶酸的紫外掃描圖在260nm處有最大吸收,在280nm處有較大吸收。烏蕨供試液中原兒茶酸、原兒茶醛峰的紫外掃描圖與對照品原兒茶酸、原兒茶醛峰的紫外掃描圖譜一致,且達(dá)到純度要求。

    2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取原兒茶酸10.11mg置10ml量瓶中,加65%乙醇溶解并稀釋至刻度,精密量取2ml置25ml量瓶中,加65%乙醇溶解并稀釋至刻度;原兒茶醛對照品10.05mg置100ml量瓶中,加65%乙醇溶解并稀釋至刻度,精密量取3ml置10ml量瓶中,加65%乙醇溶解并稀釋至刻度,得原兒茶酸(0.08088mg/mL)、原兒茶醛(0.03015mg/ml)對照品溶液。精密吸取原兒茶酸、原兒茶醛對照品溶液2、5、8、10、15μl,注入液相色譜儀,按“2.1項(xiàng)”下的色譜條件測定,記錄色譜圖,以峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量數(shù)(μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計(jì)算,原兒茶酸、原兒茶醛線性回歸方程分別為:A=1731800.51C-787.30(r=0.99996)、A=46117473.35C-1951.57(r=0.99996)。且原兒茶酸在0.1618-1.213μg/ml內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;原兒茶醛在0.06030-0.4522μg/ml內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

    2.6 精密度考察 精密吸取“2.5項(xiàng)”下原兒茶酸、原兒茶醛對照品溶液5μl,連續(xù)進(jìn)樣6次,測定峰面積,原兒茶酸、原兒茶醛峰面積的RSD分別為0.10%、1.06%,結(jié)果表明此方法有良好的精密度。

    2.7 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液分別于0、4、8、12、16、24h進(jìn)樣,進(jìn)樣量5μl,測定原兒茶酸、原兒茶醛峰面積,原兒茶酸、原兒茶醛峰面積的RSD分別為0.89%、1.22%,說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.8 重復(fù)性考察 取供試樣品,按“2.3項(xiàng)”下方法配制6份供試品溶液,按“2.1項(xiàng)”下方法,測定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g,RSD分別為1.74%、0.78%。

    2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已測定含量的樣品1.0g(原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g),置具塞錐形瓶中,精密加入原兒茶酸、原兒茶醛混合對照品溶液[精密稱取原兒茶醛對照品10.05mg,置100mL量瓶中,精密量取50ml置500ml量瓶中,另精密稱取原兒茶酸對照品10.33mg置同一500ml量瓶中,加65%乙醇溶解并稀釋至刻度,制得原兒茶酸、原兒茶醛混合對照品溶液(0.02066mg/ml、0.01005 mg/ml)]50ml,稱定重量,加熱回流60分鐘,放冷,再稱定重量,用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,進(jìn)樣5μl,記錄色譜圖,另取“2.5項(xiàng)”下原兒茶酸、原兒茶醛對照品溶液5μl,同法測定。平均回收率分別為96.70%,96.18%;RSD分別為1.30%, 1.10%。結(jié)果見表2。

    2.10 樣品測定 取供試樣品(地上部分與地下部分)分別配制供試品溶液,進(jìn)樣5μl,記錄峰面積,測定含量。見表3、表4。

    3 討論

    3.1 采挖季節(jié)對烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量有影響,冬季原兒茶酸、原兒茶醛含量下降約一半;地上部分含原兒茶酸、原兒茶醛的含量比地下部分高約1倍以上。

    3.2 比較65%乙醇、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮作溶劑,加熱回流1小時(shí)制備的供試品溶液,以65%乙醇制備的供試品溶液所測原兒茶酸、原兒茶醛的含量最高;65%乙醇作溶劑,加熱回流與超聲各1h,加熱回流所測原兒茶酸、原兒茶醛的含量較高。

    參考文獻(xiàn)

    [1]秦仁昌.中國植物志(第2卷)[M].北京:科學(xué)出版社,1959:275-279.

    [2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上冊)[M].上海:上海人民出版社,1977.

    [3]陳明,陳金秀,段萍.烏蕨的毒理學(xué)系列研究[J],中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2000,28(6):48-50.

    [4]蔡建秀,黃艷艷,許婉珍.烏蕨黃酮類化合物薄層層析及紫外光譜研究[J].泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào),2005,23(6):82-86.

    [5]蔡建秀,黃艷艷,許婉珍.烏蕨黃酮類化合物薄層成分分析[J].海峽藥學(xué),2006,29(1):99-103.

    [6]吳曉寧,張春椿.烏蕨不同部位總黃酮和元素的分析[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,33(4):587-588.

    [7]陶晨,楊小生,羅載剛,等.烏蕨中抑菌活性成分核磁共振波譜分析[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,29(6):495-496.

    [8]吳曉寧,張春椿,吳巧鳳.烏蕨總黃酮超聲提取工藝的研究[J].中國中醫(yī)藥科技,2007,14(3):190-191.

    [9]張春椿,熊耀康,顧芳芳,等.烏蕨總黃酮提取工藝研究[J].中國藥業(yè),2008,17(2):42-43.

    [10]YBZ11072004,丹參注射液[S].

    [11]何昱,成金樂,徐吉銀,等.HPLC-DAD同時(shí)測定丹參中原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA四種成分的含量[J].世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2011,12(4):688-691.

    [12]賈恒明,劉敏,張良,等.HPLC法測定狗脊補(bǔ)腎片中原兒茶酸和原兒茶醛的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2006,22(6):448-450.

    [13]謝艷,羅銳,何智建,等.狗脊炮制工藝的研究[J].臨床醫(yī)學(xué)工程,2011,18(7):1096-1098.

    [14]龔曉莉,羅婭君,史東林,等.抗菌植物烏蕨中總酚酸含量的測定[J].綿陽師范學(xué)院學(xué)報(bào),2009,28(11):41-44.

    [15]李明芳,羅婭君,李輝容.大葉金花草黃酮類化學(xué)成分的研究[J].四川師范大學(xué)學(xué)報(bào),2009,36(3):358-360.

    (收稿日期:2014.07.12)

    2.8 重復(fù)性考察 取供試樣品,按“2.3項(xiàng)”下方法配制6份供試品溶液,按“2.1項(xiàng)”下方法,測定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g,RSD分別為1.74%、0.78%。

    2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已測定含量的樣品1.0g(原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g),置具塞錐形瓶中,精密加入原兒茶酸、原兒茶醛混合對照品溶液[精密稱取原兒茶醛對照品10.05mg,置100mL量瓶中,精密量取50ml置500ml量瓶中,另精密稱取原兒茶酸對照品10.33mg置同一500ml量瓶中,加65%乙醇溶解并稀釋至刻度,制得原兒茶酸、原兒茶醛混合對照品溶液(0.02066mg/ml、0.01005 mg/ml)]50ml,稱定重量,加熱回流60分鐘,放冷,再稱定重量,用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,進(jìn)樣5μl,記錄色譜圖,另取“2.5項(xiàng)”下原兒茶酸、原兒茶醛對照品溶液5μl,同法測定。平均回收率分別為96.70%,96.18%;RSD分別為1.30%, 1.10%。結(jié)果見表2。

    2.10 樣品測定 取供試樣品(地上部分與地下部分)分別配制供試品溶液,進(jìn)樣5μl,記錄峰面積,測定含量。見表3、表4。

    3 討論

    3.1 采挖季節(jié)對烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量有影響,冬季原兒茶酸、原兒茶醛含量下降約一半;地上部分含原兒茶酸、原兒茶醛的含量比地下部分高約1倍以上。

    3.2 比較65%乙醇、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮作溶劑,加熱回流1小時(shí)制備的供試品溶液,以65%乙醇制備的供試品溶液所測原兒茶酸、原兒茶醛的含量最高;65%乙醇作溶劑,加熱回流與超聲各1h,加熱回流所測原兒茶酸、原兒茶醛的含量較高。

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    (收稿日期:2014.07.12)

    2.8 重復(fù)性考察 取供試樣品,按“2.3項(xiàng)”下方法配制6份供試品溶液,按“2.1項(xiàng)”下方法,測定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g,RSD分別為1.74%、0.78%。

    2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已測定含量的樣品1.0g(原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g),置具塞錐形瓶中,精密加入原兒茶酸、原兒茶醛混合對照品溶液[精密稱取原兒茶醛對照品10.05mg,置100mL量瓶中,精密量取50ml置500ml量瓶中,另精密稱取原兒茶酸對照品10.33mg置同一500ml量瓶中,加65%乙醇溶解并稀釋至刻度,制得原兒茶酸、原兒茶醛混合對照品溶液(0.02066mg/ml、0.01005 mg/ml)]50ml,稱定重量,加熱回流60分鐘,放冷,再稱定重量,用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,進(jìn)樣5μl,記錄色譜圖,另取“2.5項(xiàng)”下原兒茶酸、原兒茶醛對照品溶液5μl,同法測定。平均回收率分別為96.70%,96.18%;RSD分別為1.30%, 1.10%。結(jié)果見表2。

    2.10 樣品測定 取供試樣品(地上部分與地下部分)分別配制供試品溶液,進(jìn)樣5μl,記錄峰面積,測定含量。見表3、表4。

    3 討論

    3.1 采挖季節(jié)對烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量有影響,冬季原兒茶酸、原兒茶醛含量下降約一半;地上部分含原兒茶酸、原兒茶醛的含量比地下部分高約1倍以上。

    3.2 比較65%乙醇、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮作溶劑,加熱回流1小時(shí)制備的供試品溶液,以65%乙醇制備的供試品溶液所測原兒茶酸、原兒茶醛的含量最高;65%乙醇作溶劑,加熱回流與超聲各1h,加熱回流所測原兒茶酸、原兒茶醛的含量較高。

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    [9]張春椿,熊耀康,顧芳芳,等.烏蕨總黃酮提取工藝研究[J].中國藥業(yè),2008,17(2):42-43.

    [10]YBZ11072004,丹參注射液[S].

    [11]何昱,成金樂,徐吉銀,等.HPLC-DAD同時(shí)測定丹參中原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA四種成分的含量[J].世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2011,12(4):688-691.

    [12]賈恒明,劉敏,張良,等.HPLC法測定狗脊補(bǔ)腎片中原兒茶酸和原兒茶醛的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2006,22(6):448-450.

    [13]謝艷,羅銳,何智建,等.狗脊炮制工藝的研究[J].臨床醫(yī)學(xué)工程,2011,18(7):1096-1098.

    [14]龔曉莉,羅婭君,史東林,等.抗菌植物烏蕨中總酚酸含量的測定[J].綿陽師范學(xué)院學(xué)報(bào),2009,28(11):41-44.

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    (收稿日期:2014.07.12)

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