預(yù)防性給予維生素D對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦瘧前炎癥應(yīng)答的影響

朱曉彤，馮永輝，曹雅明，劉英杰

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110001;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

瘧疾是嚴(yán)重威脅人體健康的寄生原蟲(chóng)感染性疾病，全球每年至少有一百萬(wàn)人死于瘧疾感染［1］。腦瘧(Cerebral Malaria，CM)是瘧疾感染后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，是5歲以下兒童感染瘧疾致死的主要原因之一［2］。因此，研發(fā)有效抗瘧藥物和疫苗在防治瘧疾中至關(guān)重要。維生素D(Vitamin D，VD)是一種脂溶性類固醇激素，其主要作用是維持骨骼健康。但近年研究發(fā)現(xiàn)，VD在自身免疫性疾病［3］、心血管疾?。?］、感染性疾病和癌癥［5］中亦發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，VD可抑制Th1型細(xì)胞因子(IL-2和IFN-γ)、Th17細(xì)胞因子(IL-17和IL-21)的分泌，并通過(guò)刺激Th2型細(xì)胞因子(IL-4)的產(chǎn)生［6］，間接調(diào)節(jié)初始T細(xì)胞亞群向Th1、Th2和Th17各亞群的分化過(guò)程。此外，由于活化T細(xì)胞表達(dá)VD受體(VDR)，VD亦可直接抑制Th1類細(xì)胞亞群分化，并促進(jìn)調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(Tregs)分化［7］，直接影響T細(xì)胞免疫應(yīng)答。雖然VD有多種免疫調(diào)節(jié)作用，但VD在瘧疾中的研究尚處于空白。為此，本研究利用P.b ANKA感染C57BL/6小鼠建立的實(shí)驗(yàn)性腦瘧(Experimental Cerebral Malaria，ECM)模型，觀察預(yù)防性給予宿主 VD治療對(duì)于瘧疾感染后宿主免疫應(yīng)答強(qiáng)度的影響，以期為腦瘧治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘧原蟲(chóng) 6～8周齡、雌性 C57BL/6，BALB/c小鼠購(gòu)自北京動(dòng)物研究所;P.b ANKA由日本愛(ài)媛大學(xué)分子寄生蟲(chóng)學(xué)教研室惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 VD、伊文思藍(lán)及甲酰胺購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，使用前用豆油溶解;ELISA試劑盒購(gòu)自R＆d公司。

1.2 方法

1.2.1 ECM模型建立及VD處理 C57BL/6小鼠分別經(jīng)腹腔感染1×106P.b ANKA寄生的紅細(xì)胞(pRBC)建立ECM模型。于感染后每日觀察生存率，在不同時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)小鼠尾靜脈采血制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。在P.b ANKA感染前給予VD組小鼠口服VD 50 μg/kg，1次/d，連續(xù)7 d。對(duì)照組小鼠在相同的時(shí)間點(diǎn)給予同樣體積的大豆油。

1.2.2 血腦屏障通透性檢測(cè) 感染P.b ANKA后第8天，C57BL/6小鼠靜脈注射200 μL伊文思藍(lán)染料。1 h后，經(jīng)心臟灌注生理鹽水，至流出清亮的液體，取腦，放入裝有1 mL甲酰胺的中號(hào)試管中，37℃溫箱孵育48 h，3000 r/min離心15 min，取上清液，于紫外分光光度儀上(波長(zhǎng)630 nm)測(cè)定染料溢出物，檢測(cè)血腦屏障(BBB)的通透性。

1.2.3 脾細(xì)胞的制備和培養(yǎng) 感染后不同時(shí)間點(diǎn)殺鼠，留取血清。無(wú)菌條件下取出正常和感染小鼠的脾臟，采用200目篩網(wǎng)研磨后，用10 mL含10%熱滅活的小牛胎血清(FCS)，25 mmol/L Hepes，0.12%慶大霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸浮液350 × g，室溫離心 10 min，采用冷 0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞，RPMI 1640洗滌2次。采用含10%FCS的RPMI 1640將脾細(xì)胞終濃度調(diào)整至1×107個(gè)/mL，接于24孔培養(yǎng)板(FALCON)中，每孔加入500 μL細(xì)胞懸液，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)48 h，收集上清，－80℃保存，用于細(xì)胞因子及NO測(cè)定。

1.2.4 ELISA檢測(cè)和 Griess反應(yīng) 根據(jù)相應(yīng)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)脾上清和血清中IFN-γ、TNF-α和IL-10的水平。同時(shí)采用Griess反應(yīng)測(cè)定上清液中NO水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Kaplan-Meyer方法比較2組小鼠的生存期，通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)防性給予VD治療對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦瘧模型鼠感染率和生存期的影響

如圖1所示，對(duì)照組小鼠在P.b AKNA感染后9～11 d發(fā)生 ECM死亡，原蟲(chóng)血癥水平約15%。與對(duì)照組相比，VD治療組小鼠無(wú)腦瘧癥狀產(chǎn)生，原蟲(chóng)血癥水平隨感染進(jìn)程均顯著上升達(dá)61%，小鼠在感染后15～17 d死于重度貧血(與NC組相比，P＜0.01)。結(jié)果表明，預(yù)防性給予VD能保護(hù)C57BL/6小鼠發(fā)生ECM。

2.2 預(yù)防性給予VD治療對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦瘧模型鼠血腦屏障完整性的影響

在感染后第8天，小鼠尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)染料，通過(guò)測(cè)定伊文思藍(lán)染料外滲量檢測(cè)血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的完整性。與對(duì)照組相比，預(yù)防性給予VD治療組小鼠腦組織的伊文思藍(lán)滲出顯著減少(圖2)。這一觀察結(jié)果表明，預(yù)防性給予VD治療可顯著改善ECM小鼠的腦血管完整性。

圖1 預(yù)防給予VD對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦瘧模型感染率(A)和生存期(B)的影響Fig.1 Effects of pre-treatment with vitamin D on the parasitemia and survival of ECM

圖2 預(yù)防給予VD對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦瘧模型血腦屏障的影響Fig.2 Effects of pre-treatment with vitamin D on BBB of ECM mice

2.3 預(yù)防性給予VD治療對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦瘧模型鼠前炎癥細(xì)胞因子水平的影響

在小鼠感染后第0、3、5和8天，檢測(cè)VD組和對(duì)照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清(圖3A、B)和血清(圖3D、E)中IFN-γ和 TNF-α 水平。研究發(fā)現(xiàn)，在感染后第5、8天，對(duì)照組脾上清和血清中IFN-γ及TNF-α水平顯著升高。VD組TNF-α水平在感染后第5天亦顯著升高。在感染后第8天，VD組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。同時(shí)血清中的IFN-γ和TNF-α水平在感染后第5天，VD組顯著低于對(duì)照組(P ＜0.05)。

進(jìn)一步分析預(yù)防性給予VD治療對(duì)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO(圖3C)產(chǎn)生水平的影響發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組在感染后第5天和第8天NO水平顯著升高相比，P.b ANKA感染后VD組NO水平無(wú)明顯上升，且在感染后第5天和第8天均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。上述研究結(jié)果表明，VD預(yù)防性給藥治療能夠調(diào)節(jié)瘧疾感染早期宿主前炎癥免疫應(yīng)答反應(yīng)。

圖3 預(yù)防給予VD對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦瘧模型前炎癥細(xì)胞因子的影響Fig.3 Effects of pre-treatment with vitamin D on pro-inflammatory cytokines

2.4 預(yù)防性給予VD對(duì)抗炎性細(xì)胞因子IL-10的影響

抗炎性細(xì)胞因子IL-10對(duì)Th1型免疫應(yīng)答具有抑制作用，因此本研究檢測(cè)了脾上清(圖4A)和血清(圖4B)中IL-10水平。研究發(fā)現(xiàn)，在感染后第5、8天，對(duì)照組和VD組IL-10分泌水平均顯著增加，但VD組感染后第5、8天IL-10的分泌明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。此研究結(jié)果表明，VD治療可以增加IL-10分泌水平，從而抑制P.b ANKA感染后ECM的發(fā)生。

圖4 預(yù)防性給予VD對(duì)抑制性細(xì)胞因子IL-10的影響Fig.4 Effects of pre-treatment with vitamin D on IL-10

3 討論

有研究表明，高原蟲(chóng)血癥和過(guò)強(qiáng)的前炎癥免疫應(yīng)答是導(dǎo)致CM發(fā)生的重要因素［8］，而VD具有抑制前炎癥免疫應(yīng)答反應(yīng)，減少自身免疫性疾病癥狀發(fā)生的作用［9］。本研究結(jié)果表明預(yù)防性給予VD治療，可通過(guò)抑制ECM模型小鼠過(guò)強(qiáng)的前炎癥應(yīng)答，從而延長(zhǎng)小鼠生存期。

瘧原蟲(chóng)感染小鼠早期前炎癥細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α 和 NO 分泌水平顯著上升［10-11］。研究表明，過(guò)強(qiáng)的Th1免疫應(yīng)答在CM病理中發(fā)揮重要作用［12］，可促進(jìn)腦瘧發(fā)生。中和小鼠體內(nèi)的IFN-γ可防止CM的發(fā)生并降低死亡率［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防性給予VD治療，可顯著降低P.b ANKA感染小鼠體內(nèi)IFN-γ和TNF-α水平。

早期研究顯示，瘧疾感染過(guò)程中NO分泌水平顯著增加。作為固有免疫應(yīng)答的重要組成部分，NO由脾臟中巨噬細(xì)胞產(chǎn)生［14］。高水平 NO可殺死瘧原蟲(chóng)但也會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生不良影響。高濃度NO可能會(huì)擾亂其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致意識(shí)障礙的腦型瘧疾的發(fā)生［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，P.b ANKA感染前，預(yù)防性給予VD可抑制感染過(guò)程中NO的分泌。由于前炎癥細(xì)胞因子水平顯著降低，可保護(hù)小鼠抵御腦瘧發(fā)生。

VD單獨(dú)或聯(lián)合地塞米松可在APC體外系統(tǒng)誘導(dǎo) Tregs產(chǎn)生 IL-10［16］，Baeke 等報(bào)道，VD 可誘導(dǎo)CD4+CD25highCD127low表型的Tregs分化成熟，并選擇性誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞亞群表達(dá)IL-10，在自身免疫性疾病和器官移植排斥反應(yīng)中對(duì)宿主起到保護(hù)性作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，VD預(yù)防性給藥治療可以通過(guò)提高IL-10水平抑制ECM發(fā)生。

前炎癥和抗炎癥免疫應(yīng)答之間的平衡對(duì)控制瘧疾發(fā)病至關(guān)重要。本研究表明，預(yù)防性給予VD治療，可通過(guò)抑制宿主過(guò)強(qiáng)的前炎癥免疫應(yīng)答防止腦瘧的發(fā)生，從而延長(zhǎng)小鼠生存期。上述研究結(jié)果為瘧疾防治的研究提供了有力的理論依據(jù)。

［1］Rénia L，Howland SW.Targeting the olfactory bulb during experimental cerebral malaria［J］.Trends Parasitol，2014，pii:S1471-4922(14)00088-9.

［2］Kotlyar S，Nteziyaremye J，Olupot-Olupot P，et al.Spleen volume and clinical disease manifestations of severe Plasmodium falciparum malaria in African children［J］.Trans R Soc Trop Med Hyg，2014，108(5):283-289.

［3］Costenbader KH，F(xiàn)eskanich D，Holmes M，et al.itamin D intake and risks of systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis in women［J］.Ann Rheum Dis，2008，67(4):530-535.

［4］Van der Schueren BJ，Verstuyf A，Mathieu C.Straight from DHeart:vitamin D status and cardiovascular disease［J］.Curr Opin Lipidol，2012，23(1):17-23.

［5］Toriola AT，Nguyen N，Scheitler-Ring K，et al.Circulating 25-hydroxyvitamin D Levels and Prognosis among Cancer Patients:A Systematic Review［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2014，23(6):917-933.

［6］Giulietti A，van Etten E，Overbergh L，et al.Monocytes from type 2 diabetic patients have a pro-inflammatory profile.1，25-Dihydroxyvitamin D(3)works as anti-inflammatory［J］.Diabetes Res Clin Pract，2007，77(1):47-57.

［7］Jeffery LE，Burke F，Mura M，et al.1，25-Dihydroxyvitamin D3 and IL-2 combine to inhibit T cell production of inflammatory cytokines and promote development of regulatory T cells expressing CTLA-4 and FoxP3［J］.J Immunol，2009，183(9):5458-5467.

［8］Pais TF，Chatterjee S.Brain macrophage activation in murine cerebral malaria precedes accumulation of leukocytes and CD8+T cell proliferation［J］.J Neuroimmunol，2005，163(1-2):73-83.

［9］Cantorna MT，Munsick C，Bemiss C，et al.1，25-Dihydroxycholecalciferol prevents and ameliorates symptoms of experimental murine inflammatory bowel disease［J］.J Nutr，2000，130(11):2648-2652.

［10］Su Z，Stevenson MM.Central role of endogenous gamma interferon in protective immunity against blood-stage Plasmodium chabaudi AS infection［J］.Infect Immun，2000，68(8):4399-4406.

［11］Dascombe MJ，Nahrevanian H.Pharmacological assessment of the role of nitric oxide in mice infected with lethal and nonlethal species of malaria［J］.Parasite Immunol，2003，25(3):149-159.

［12］Belnoue E，Kayibanda M，Vigario AM，et al.On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+T cells in experimental cerebral malaria［J］.J Immunol，2002，169(11):6369-6375.

［13］Ya～nez DM，Manning DD，Cooley AJ，et al.Participation of lymphocyte subpopulations in the pathogenesis of experimental murine cerebral malaria［J］.J Immunol，1996，157(4):1620-1624.

［14］Breuillard C，Belabed L，Bonhomme S，et al.Arginine availability modulates arginine metabolism and TNFα production in peritoneal macrophages from Zucker Diabetic Fatty rats［J］.Clin Nutr，2012，31(3):415-421.

［15］Clark IA，Cowden WB.The pathophysiology of falciparum malaria［J］.Pharmacol Ther，2003，99(2):221-260.

［16］Unger WW，Laban S，Kleijwegt FS，et al.Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone:differential role for PD-L1［J］.Eur J Immunol，2009，39(11):3147-3159.

［17］Spach KM，Nashold FE，Dittel BN，et al.IL-10 signaling is essential for 1，25-dihydroxyvitamin D3-mediated inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Immunol，2006，177(9):6030-6037.