siRNA沉默SIRT1基因?qū)m頸癌細(xì)胞HeLa增殖和凋亡的影響

吳 琦，于 紅，張文卿

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教研室，山東 青島 266071)

沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的去乙?；割悾琒IRT1通過對多種組蛋白及非組蛋白底物的去乙?；饔?，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)和染色質(zhì)重塑，進(jìn)而參與代謝、細(xì)胞分化、衰老、凋亡及腫瘤發(fā)展等生理及病理生理過程［1］。研究表明SIRT1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥密切相關(guān)，有望成為腫瘤表觀遺傳學(xué)治療的良好靶標(biāo)［2］。RNA 干擾(RNA interference，RNAi)是雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，導(dǎo)入細(xì)胞后雙鏈RNA可特異性地識別并結(jié)合與其序列互補(bǔ)的核酸片段，進(jìn)而降解內(nèi)源性的mRNA，形成特定基因的表達(dá)沉默［3-4］。RNA干擾具有高特異性和高效性的特點，已成為研究基因功能、信號傳導(dǎo)通路、腫瘤治療的重要工具之一。本研究化學(xué)合成靶向 SIRT1的 siRNA(small interference RNA，siRNA)并轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞株 HeLa，觀察 siRNA SIRT1對HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa由本實驗室保存。靶向SIRT1的siRNA(5'-ACUUUGCUGUAACCCUGUAdTdT-3')及無義序列siRNA委托Life technology公司合成;Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購自Life technology公司。hGAPDH、SIRT1基因引物由Life technology公司合成。細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購自武漢博士德生物工程有限公司;P53一抗、P21一抗、Survivin一抗為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;β-actin一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗為北京中杉生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;SIRT1一抗購自Abcam公司。HRP增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物SuperSignal West Pico購自Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA SIRT1轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化 分別用終濃度為15、30及45 nmol/L的siRNA SIRT1轉(zhuǎn)染30% ～50%匯合的HeLa細(xì)胞，同時設(shè)陰性對照組(轉(zhuǎn)染通用無義序列siRNA)及正常細(xì)胞對照組，于轉(zhuǎn)染后72 h倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測。

1.2.2 RT-PCR檢測SIRT1 mRNA 于轉(zhuǎn)染后72 h收集各組細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR檢測SIRT1 mRNA表達(dá)水平。SIRT1 PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃、10 min，變性 94℃、1 min，退火47 ℃、1 min，延伸72 ℃、1 min，30 個循環(huán)后，延伸72℃、10 min。內(nèi)參照hGAPDH PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃、10 min，變性94℃、30 s，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，30個循環(huán)后，延伸72℃、10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像系統(tǒng)對目的條帶進(jìn)行掃描，Image J軟件進(jìn)行灰度分析，計算SIRT1灰度值與hGAPDH灰度值之比，即SIRT1 mRNA的相對表達(dá)量。每組實驗重復(fù)3次。SIRT1及hGAPDH引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primers

1.2.3 Western blot檢測 SIRT1 及凋亡相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)染72 h后收集各組細(xì)胞并加入WIP組織細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，常規(guī)進(jìn)行Western blot檢測，一抗稀釋比例為1∶(300～3000)，二抗稀釋比例為1∶5000，化學(xué)發(fā)光法顯色。Image J軟件進(jìn)行灰度分析，將目的基因與內(nèi)參β-actin條帶的灰度值比值作為目的基因的相對表達(dá)量。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 HeLa細(xì)胞接種于96孔板，每孔3×103個細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞至30% ～50%匯合，以終濃度30 nmol siRNA SIRT1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72 h，每孔加10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀測450 nm處吸光度值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(正常組A值－實驗組A值)/正常組A值×100%。

1.2.5 Hoechst33258核染色 取 siRNA轉(zhuǎn)染后72 h的HeLa細(xì)胞，常規(guī)進(jìn)行Hoechst33258染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6 Annexin-Ⅴ檢測細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染后72 h各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至(2～5)×105/mL，于Ep管中依次加入100 μL單細(xì)胞懸液及100 μL Guava Nexin Reagent(含有 Annexin V-PE和7-ADD的緩沖液)混勻避光，室溫孵育20 min，流式細(xì)胞儀上樣分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉχ±s)表示，采用單因素方差分析 RT-PCR、Western blot結(jié)果，以檢驗水準(zhǔn) α =0.05，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 siRNA SIRT1轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與正常HeLa細(xì)胞組比較，不同劑量 siRNA SIRT1(15、30、45 nmol/L)轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后，均可見大量脫落變圓的細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果顯示，與正常HeLa細(xì)胞組相比，各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中SIRT1 mRNA的表達(dá)水平均明顯下降，其中以30 nmol/L的siRNA作用最為明顯，因此，后續(xù)實驗選用30 nmol/L作為siRNA的轉(zhuǎn)染濃度(圖1)。

圖1 不同劑量siRNA SIRT1對HeLa細(xì)胞SIRT1 mRNA的影響Fig.1 Effect of various concentration of siRNA on SIRT1 mRNA expression

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果表明，與正常HeLa細(xì)胞組相比，siRNA SIRT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中SIRT1 mRNA水平明顯下降，差異有顯著性(圖2，P ＜0.05)，而陰性siRNA轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染試劑對照組細(xì)胞SIRT1 mRNA水平無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 Western blot檢測結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果表明，與正常組相比，siRNA SIRT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞SIRT1、Survivin蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.01)，P53、P21蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.01);陰性 siRNA轉(zhuǎn)染組SIRT1、P53、P21、Survivin 蛋白表達(dá)水平的變化無顯著性(P＞0.05);轉(zhuǎn)染試劑對照組SIRT1、P21蛋白表達(dá)水平的變化無顯著性(P＞0.05)，但Survivin蛋白相對表達(dá)量降低(P＜0.05，圖3)。

圖2 RNA干擾對SIRT1 mRNA的表達(dá)影響Fig.2 Effect of RNA interference on the expression of SIRT1 mRNA

2.4 細(xì)胞增殖檢測結(jié)果

CCK-8結(jié)果顯示，siRNA SIRT1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞72 h后，對HeLa細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，siRNA SIRT1轉(zhuǎn)染組抑制率為39%，明顯高于其他3組(圖4)，表明siRNA SIRT1可抑制HeLa細(xì)胞增殖。

2.5 Hoechst33258 核染色

熒光顯微鏡下顯示，正常對照組、陰性siRNA轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染試劑對照組細(xì)胞的細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色，而siRNA SIRT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞核染色質(zhì)高度濃縮，可觀察到亮藍(lán)色細(xì)胞核(圖5)。

2.6 AnnexinⅤ-PE檢測細(xì)胞凋亡

結(jié)果顯示，正常組凋亡率為3%，陰性siRNA轉(zhuǎn)染組凋亡率為3.9%，轉(zhuǎn)染試劑對照組凋亡率為3.3%，siRNA SIRT1轉(zhuǎn)染組凋亡率為15.9%。siRNA SIRT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他3組，表明siRNA SIRT1可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡(P＜0.05，圖 6)。

圖3 RNA干擾對SIRT1及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of RNA interference on the expression of SIRT1 and apoptosis related protein

圖4 RNA干擾對HeLa細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of RNA interference on HeLa cell proliferation

圖5 HeLa細(xì)胞的Hoechst33258染色(200×)Fig.5 Hoechst33258 stain of HeLa cells(200 × )

圖6 AnnexinⅤ-PE檢測HeLa細(xì)胞凋亡Fig.6 AnnexinⅤ-PE analysis of apoptosis in HeLa cells

3 討論

乙?；?去乙酰化是一種重要的組蛋白修飾方式，由組蛋白乙?；?histone acetylase，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)催化完成［5］。SIRT1屬于Ⅲ類組蛋白去乙?；讣易宄蓡T，SIRT1不僅去乙酰化修飾多種組蛋白，還可以去乙?；饔枚喾N非組蛋白，包括轉(zhuǎn)錄因子P53，叉頭蛋白盒轉(zhuǎn)錄因子 FOXO，核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)等，進(jìn)而影響與腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡密切相關(guān)的多種蛋白活性［6］。研究表明SIRT1在腫瘤中呈異質(zhì)性表達(dá)，隨腫瘤類型的不同 SIRT1的表達(dá)水平不一致［6-7］，因此，將SIRT1歸為癌基因還是抑癌基因仍存在爭議。大多數(shù)文獻(xiàn)報道SIRT1在賁門癌、急性髓性白血病、人前列腺癌、原發(fā)性結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤組織中持續(xù)高表達(dá)，且具有鈍化抑癌基因和DNA損傷修復(fù)蛋白的作用，被認(rèn)為是腫瘤促進(jìn)因子［1，6-7］。但也有研究報道在某些特定的情況下，SIRT1起到抑癌因子的作用，F(xiàn)irestein等研究證實，將SIRT1轉(zhuǎn)入APCmin/+小鼠結(jié)腸癌中，SIRT1可抑制腫瘤的形成和生長［8］。進(jìn)一步研究證明，SIRT1通過去乙酰化作用抑制癌基因β-catenin、NF-κB的轉(zhuǎn)錄和癌蛋白活性，從而起到腫瘤抑制因子的作用。

目前關(guān)于SIRT1與宮頸癌的相關(guān)性研究鮮見文獻(xiàn)報道。有學(xué)者報道沉默宮頸癌細(xì)胞株SiHa中HPV E7蛋白，可下調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá);在原代人角質(zhì)形成細(xì)胞中過表達(dá)HPV E7蛋白，可上調(diào)SIRT1蛋白及其磷酸化的表達(dá)，提示SIRT1可能參與了HPV致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的過程［9］，但SIRT1在宮頸癌中的作用及詳盡機(jī)制尚不清楚。

本實驗參照文獻(xiàn)［10］設(shè)計針對SIRT1基因的siRNA，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，結(jié)果表明siRNA SIRT1能明顯下調(diào)SIRT1的表達(dá)，抑制HeLa細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步檢測了凋亡相關(guān)蛋白P53、P21及Survivin的表達(dá)，結(jié)果表明P53、P21表達(dá)上調(diào)，Survivin表達(dá)下調(diào)，提示siRNA SIRT1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與P53通路密切相關(guān)。P53為腫瘤抑制因子，在DNA損傷、紫外線、化學(xué)藥物刺激、異常細(xì)胞生長時可在細(xì)胞核內(nèi)聚集，通過調(diào)控P21、Bax、Survivin等下游蛋白的活性，抑制細(xì)胞分裂和促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11-12］。其中P21蛋白不僅能夠與cyclin/cdk形成復(fù)合物使細(xì)胞周期停滯在G1期，而且還可以通過C端與增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)相互作用，阻斷PCNA活化DNA聚合酶的活性從而抑制DNA的合成，使細(xì)胞周期停滯［13］;而Survivin為凋亡抑制蛋白家族成員，可直接或通過P21間接作用于Caspase和周期蛋白激酶，阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，P53通過對Survivin啟動子的調(diào)控，發(fā)揮其負(fù)向調(diào)節(jié)作用［14］。因此，推測沉默SIRT1基因誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡與P53、P21及Survivin通路關(guān)系密切，但是由于SIRT1作用底物較多，底物間相互作用機(jī)制復(fù)雜，siRNA SIRT1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的詳盡機(jī)制尚有待進(jìn)一步探索。

［1］Brooks CL，Gu W.How does SIRT1 affect metabolism，senescence and cancer?［J］.Nat Rev Cancer，2009，9(2):123-128.

［2］曹瓊，黃朝鳳，金戈.SIRTl表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞多藥耐藥性的關(guān)系［J］.中國老年學(xué)雜志，2012，32(2):339-340.

［3］Pauley KM，Cha S.RNAi Therapeutics in Autoimmune Disease［J］.Pharmaceuticals，2013，6(3):287-294.

［4］范守城，張云茹.RNAi技術(shù)研究進(jìn)展及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景［J］.微生物學(xué)雜志，2009，29(4):93-98.

［5］Kouzarides T.Chromatin modifications and their function［J］.Cell，2007，128(4):693-705.

［6］Deng CX.SIRT1，is it a tumor promoter or tumor suppressor［J］.Int J Biol Sci，2009，5(2):147-152.

［7］Li K，Luo J.The role of SIRT1 in tumorigenesis［J］.N Am J Med Sci，2011，4(2):104-106.

［8］Firestein R，Blander G，Michan S，et al.The SIRT1 deacetylase suppresses intestinal tumorigenesis and colon cancer growth［J］.Plos one，2008，3(4):e2020.

［9］Allison SJ，Jiang M，Milner J.Oncogenic viral protein HPV E7 up-regulates the SIRT1 longevity protein in human cervical cancer cells［J］.Aging，2009，1(3):316-327.

［10］Ford J，Jiang M，Milner JO.Cancer-specific functions of SIRT1 enable human epithelial cancer cell growth and survival［J］.Cancer Res，2005，65(22):10457-10463.

［11］Han MK，Song EK，Guo Y，et al.SIRT1 regulates apoptosis and Nanog expression in mouse embryonic stem cells by controlling p53 subcellular localization［J］.Cell Stem Cell，2008，2(3):241-251.

［12］Geng Y，Walls KC，Ghosh AP，et al.Cytoplasmic p53 and activated Bax regulate p53-dependent，transcription-independent neural precursor cell apoptosis［J］.J Histochem Cytochem，2010，58(3):265-275.

［13］Gillis LD，Leidal AM，Hill R，et al.p21Cip1/WAF1 mediates cyclin B1 degradation in response to DNA damage［J］.Cell Cycle，2009，8(2):253-256.

［14］Guha M，Altieri DC.Survivin as a global target of intrinsic tumor suppression networks［J］.Cell Cycle，2009，8(17):2708-2710.