化療藥物對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)的影響

焦 雪，王士勇*，劉 暢，劉迪杰，單風(fēng)平

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院生物治療科，遼寧 沈陽(yáng) 110032;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine-induced killer cells，CIK)是一種新型的免疫活性細(xì)胞，是人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，兼具T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的殺瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性，作為一種新的治療手段，安全、有效，已廣泛應(yīng)用于多種血液和實(shí)體腫瘤的治療。近年來(lái)研究表明，化療聯(lián)合CIK細(xì)胞治療肺癌、腎癌、鼻咽癌和肝癌等各種腫瘤均獲得顯著的療效［1］。但是，當(dāng)化療與CIK聯(lián)合時(shí)，采用何種方式，包括化療后間隔多長(zhǎng)時(shí)間輸注CIK細(xì)胞才是恰當(dāng)?shù)模幻鞔_。為此，必須明確化療藥物對(duì)CIK細(xì)胞增殖活性及CIK細(xì)胞亞群的影響，特別是對(duì)效應(yīng)細(xì)胞 CD3+CD56+和CD3+CD8+的影響。本文選用了臨床上常用的幾種化療藥物，采用不同的藥物濃度，體外檢測(cè)了對(duì)CIK細(xì)胞增殖活性的影響，以此模擬化療藥物體內(nèi)代謝過(guò)程中不同時(shí)間對(duì)CIK及其亞群的影響，從而明確化療后CIK輸注的時(shí)機(jī)，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 人淋巴細(xì)胞分離液(天津景洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號(hào):30130508-0364);抗CD3單克隆抗體(天津美德太平洋科技有限公司，批號(hào):231301A);重組人 IFN-γ(美國(guó) PEPROTECH公司，批號(hào):121127);IL-1α(美國(guó) PEPROTECH公司，批號(hào):060811);重組人IL-2(山東泉港藥業(yè)有限公司，批號(hào):201306001);無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液(日本 Cell Science ＆ Technology Inst.，Inc，批號(hào):191303A);四色淋巴細(xì)胞亞群分析試劑盒(美國(guó)BD公司，批號(hào):79890);MTT(德國(guó)Sigma公司，批號(hào):1017130D);順鉑(齊魯制藥有限公司，批號(hào):20130920);氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào):1307101);紫杉醇(哈藥集團(tuán)生物工程有限公司，批號(hào):20130602);地塞米松磷酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號(hào):13062011)。

1.1.2 儀器 FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力新儀器設(shè)備公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)Multiskan Mk3)。

1.2 方法

1.2.1 CIK細(xì)胞制備 按照本實(shí)驗(yàn)室既往報(bào)告的方法進(jìn)行［6］，簡(jiǎn)述如下:選取10名健康志愿者，男、女各5人，年齡25～50歲，平均年齡(37.23±11.72)歲，分別抽取外周血20 mL，用淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，培養(yǎng)當(dāng)天加入重組人IFN-γ(1000 U/mL)，24 h后加入IL-1α(500 U/mL)、IL-2(1000 U/mL)和 CD3 單抗(1/μg/mL)，4 d 后僅加入 IL-2(1000 U/mL)和無(wú)血清培養(yǎng)基［5］，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 體外檢測(cè)化療藥物對(duì)CIK細(xì)胞增殖活性的影響 采用MTT法，取第20天的CIK細(xì)胞，接種到96孔板，每孔加入1×106個(gè) CIK細(xì)胞，37℃、5%CO2孵育4 h，將不同濃度順鉑、氟尿嘧啶、紫杉醇及地塞米松分別接種于相應(yīng)孔內(nèi)，每種藥物設(shè)4組:培養(yǎng)液空白對(duì)照組、CIK細(xì)胞對(duì)照組、CIK+藥物組、CIK+藥物組+IL-2組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。共培養(yǎng)24～72 h，洗滌2次、加入MTT 20 μL(終濃度為 5 mg/mL)，共孵育 4 h，1500 r/min離心10 min，棄上清、加入二甲基亞砜 150 μL，10 min震蕩混勻，570 nm測(cè)量各孔OD值，計(jì)算增殖活性。計(jì)算公式:增殖活性(%)=((實(shí)驗(yàn)組OD值－空白對(duì)照組OD值)/CIK細(xì)胞對(duì)照組OD值)×100%

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群取待檢測(cè)的CIK細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，分別取100 μL加入A、B兩管，四色淋巴細(xì)胞亞群分析試劑盒(A:D45-PerCP/CD3-FITC/CD4-APC/CD8-PE;B:CD45-PerCP CD3-FITC/CD16+56-PE/CD19-APC)染色，向A管內(nèi)加入A液20 μL，B管內(nèi)加入B液20 μL，室溫避光染色30 min，再加入PBS 450 μL，充分混勻，室溫避光15 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+細(xì)胞比例，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用樣本均數(shù)t檢驗(yàn)比較兩組差異，多組資料比較采用方差分析，組間比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 化療藥物對(duì)CIK細(xì)胞增殖活性的影響

本實(shí)驗(yàn)選用了臨床常用的3種化療藥物及一種細(xì)胞回輸?shù)妮o助用藥地塞米松，每種藥物設(shè)6～7種濃度，與CIK細(xì)胞作用24～72 h，圖1為作用24 h的結(jié)果。順鉑、氟尿嘧啶、紫杉醇及地塞米松對(duì)CIK細(xì)胞的增殖活性均產(chǎn)生顯著影響，其中順鉑和紫杉醇表現(xiàn)出明顯的濃度依賴(lài)性，差異顯著(P＜0.05)(圖1A、B);5-氟尿嘧啶在極低的濃度對(duì)CIK細(xì)胞即有影響，但隨著濃度的增加對(duì)CIK細(xì)胞毒性并未增加(圖1C)。地塞米松同樣在低濃度即可影響CIK細(xì)胞的增殖，隨著濃度增加對(duì)CIK細(xì)胞的毒性并未增加(圖1D)。IL-2可提高CIK細(xì)胞的增殖活性，特別是在5-氟尿嘧啶和地塞米松組(P＜0.05)，而在順鉑組和紫杉醇組保護(hù)作用極低(見(jiàn)圖1)。藥物與CIK細(xì)胞作用48、72 h，與作用24 h的結(jié)果呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì)(圖未給出)。

圖1 化療藥物及地塞米松對(duì)CIK細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 Effect of chmomedicine and dexamethasone on proliferative viability of CIK cells

2.2 化療藥物對(duì) CIK細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群的影響

為了解各種藥物對(duì)CIK亞群的影響，每種藥物取2種濃度，體外與CIK細(xì)胞作用24～72 h。90%抑制濃度順鉑(5 μg/mL)與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)24 h的結(jié)果如下(見(jiàn)表1、圖2～4)。

圖2 順鉑對(duì)CD3+CD4+細(xì)胞亞群的影響Fig.2 Effect of DDP on proportions of CD3+CD4+sunsets

圖3 順鉑對(duì)CD3+CD8+細(xì)胞亞群的影響Fig.3 Effect of DDP on proportions of CD3+CD8+sunsets

圖4 順鉑對(duì)CD3+CD56+細(xì)胞亞群的影響Fig.4 Effect of DDP on proportions of CD3+CD4+sunsets

表1 順鉑對(duì)CIK細(xì)胞淋巴細(xì)胞的影響Table 1 Effect of DDP on proportions of lymphocyte sunsets

3 討論

CIK細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞為CD3+CD56+亞群淋巴細(xì)胞，該細(xì)胞亞群同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，其殺瘤活性具有非MHC限制性。CD3+CD56+CIK細(xì)胞主要通過(guò)釋放含有細(xì)胞溶解毒素的細(xì)胞顆粒由細(xì)胞膜滲透進(jìn)靶細(xì)胞從而引起靶細(xì)胞的溶解，起到對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用［3］。在培養(yǎng)CIK細(xì)胞的過(guò)程中，活化后的CIK 細(xì)胞可產(chǎn)生大量的 TNF-α、GM-CSF、IFN-γ 等細(xì)胞炎性因子，可以通過(guò)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用間接殺傷腫瘤細(xì)胞［4］。近年來(lái)研究表明，化療聯(lián)合CIK細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性腎癌取得了良好的近期療效［5］，胃癌患者術(shù)后化療聯(lián)合CIK免疫治療可以顯著延長(zhǎng)患者生存期［6］，支氣管動(dòng)脈灌注化療聯(lián)合CIK細(xì)胞治療非小細(xì)胞肺癌療效優(yōu)于全身靜脈化療［7］，肝動(dòng)脈栓塞化療聯(lián)合CIK細(xì)胞療法可提高原發(fā)性肝癌患者的遠(yuǎn)期生存率［8］。目前，化療聯(lián)合CIK細(xì)胞治療已廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療，但是，當(dāng)化療與CIK聯(lián)合時(shí)，化療藥物會(huì)對(duì)CIK細(xì)胞產(chǎn)生多大影響以及化療后間隔多長(zhǎng)時(shí)間回輸CIK細(xì)胞尚未見(jiàn)明確報(bào)道。

順鉑是一種周期非特異性抗腫瘤藥物，靜脈注射后主要分布于肝、腎、腸道及皮膚組織中，血漿半衰期55～73 h，全劑量注入5 d內(nèi)僅有27%～43%排除體外。臨床常用劑量為75 mg/m2，按人均 1.7 m2、60 kg 計(jì)算，相當(dāng)于 2.1 μg/mL。根據(jù)本實(shí)驗(yàn) MTT結(jié)果，加入 IL-2組順鉑濃度為0.156 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖活性為90%，按半衰期55～73 h可推測(cè)順鉑治療后10～14 d回輸CIK細(xì)胞同時(shí)加入IL-2可以保持細(xì)胞增殖活性 ＞90%。氟尿嘧啶為抗代謝類(lèi)廣譜抗腫瘤藥物，靜脈用藥后廣泛分布于體液中，半衰期很短，僅10～20 min，并在4 h內(nèi)從血中消失，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氟尿嘧啶對(duì)CIK細(xì)胞影響較弱，加入IL-2組CIK增殖活性顯著提高，因而氟尿嘧啶治療后1～2 d即可回輸CIK細(xì)胞。紫杉醇是一種天然來(lái)源抗腫瘤藥物，主要在肝臟代謝，血漿半衰期5.8 h，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CIK細(xì)胞對(duì)紫杉醇的殺傷作用較敏感，根據(jù)半衰期5.8 h推測(cè)紫杉醇在體內(nèi)完全代謝約需3～4 d，因而建議紫杉醇治療3～4 d開(kāi)始回輸CIK細(xì)胞。從以上3種細(xì)胞毒性藥物對(duì)CIK的影響來(lái)看，化療后1周左右回輸CIK細(xì)胞應(yīng)該是可行的，但是含有順鉑的方案應(yīng)延長(zhǎng)回輸?shù)臅r(shí)間，或者選擇水化等方式，加快其排泄。地塞米松為糖皮質(zhì)類(lèi)激素藥物，具有抗炎、抗內(nèi)毒素、抑制免疫、應(yīng)激及抗休克等藥理作用，血漿半衰期為190 min，主要用于在CIK細(xì)胞回輸過(guò)程中可能出現(xiàn)的過(guò)敏反應(yīng)及輸液反應(yīng)的患者。本實(shí)驗(yàn)明確了地塞米松有抑制CIK細(xì)胞增殖的作用，但其是否對(duì)殺傷活性有影響，尚不明確。因此，應(yīng)慎用地塞米松。

IL-2(interleukin-2)是一種T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，主要由活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物活性［9-10］。研究表明，IL-2可誘導(dǎo)細(xì)胞溶解酶顆粒聚集，從而增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性［11-12］。本研究結(jié)果證明，在低濃度的化療藥物作用下，IL-2可提高CIK細(xì)胞的增殖活性。此外，我們另外的體外殺傷實(shí)驗(yàn)證明，CIK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)，加入IL-2可提高其殺傷活性。因此，在應(yīng)用CIK細(xì)胞治療時(shí)，應(yīng)同時(shí)給予IL-2，以保持CIK細(xì)胞的增殖和殺傷活性。

本文根據(jù)以上3種化療藥物的臨床最大用藥劑量設(shè)置濃度梯度，以模擬體內(nèi)代謝過(guò)程中不同時(shí)間對(duì)CIK細(xì)胞的影響，從而明確化療后CIK細(xì)胞治療的時(shí)機(jī)。建議根據(jù)不同化療藥物體內(nèi)代謝半衰期的長(zhǎng)短以及患者情況制定個(gè)體化的治療方案，在CIK細(xì)胞治療的同時(shí)給予IL-2，從而提高CIK細(xì)胞的治療效率。此外，進(jìn)行CIK細(xì)胞治療時(shí)盡量減少地塞米松的使用。

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