酸溶輔助超聲波法提取類球紅細菌類胡蘿卜素條件優(yōu)化

李祖明，張 猛，張 靜，高麗萍，惠伯棣，楊衛(wèi)東，王 棟，白志輝

(1.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191;2.北京天維新探生物科技有限公司，北京 100176;3.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085)

類胡蘿卜素是一類黃色、橙紅色或紅色的天 然色素的總稱，是一種多烯類化合物。類胡蘿卜素能夠預(yù)防癌癥，提高人體免疫力，為人體補充必需的維生素，是一種重要的抗氧化物?，F(xiàn)有研究表明類胡蘿卜素具有食品著色劑和營養(yǎng)增補劑的雙重功效，因而被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和飼料添加劑中［1-2］。目前，類胡蘿卜素已成為主要的研究熱點課題之一［3-4］。人們獲得類胡蘿卜素主要是通過化學(xué)合成、植物提取和微生物發(fā)酵途徑，化學(xué)合成類胡蘿卜素因毒性其應(yīng)用受到限制［5］;植物提取法獲得類胡蘿卜素存在受季節(jié)限制、產(chǎn)量較低、成本較高的劣勢［6］;微生物合成類胡蘿卜素因其高效和易于操控而越來越受到廣泛關(guān)注［7］。一些光合微生物，例如細菌、酵母和霉菌同樣具有合成類胡蘿卜素的能力［8-9］。類球紅細菌屬光合細菌，屬于細菌域中紫色細菌群的A亞群，具有廣泛的代謝方式，已成為一種非常有工業(yè)化開發(fā)潛力的微生物［10-11］。已有文獻報道了從生物材料中提取類胡蘿卜素，卻鮮有從類球紅細菌中提取類胡蘿卜素的文獻報道［4］。超聲波破碎法因具有利于生理活性物質(zhì)保持活性、提取速度快、工藝可行等特點，在類胡蘿卜素的提取中得到應(yīng)用［12］。Gu 等［4］研究表明酸溶法提取類球紅細菌類胡蘿卜素效果較好。本實驗采用酸溶輔助超聲波法提取類球紅細菌類胡蘿卜素，通過單因素實驗和正交實驗確定其最佳的提取條件，為其深入研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)3757菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號 CGMCC NO.3757。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基(w/v):葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母提取物1%，氯化鈉0.5%，pH 7.2;固體培養(yǎng)基(w/v):在種子培養(yǎng)基中添加2%瓊脂;發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):蘋果酸鈉0.4%，葡萄糖2%，硫酸銨0.7%，酵母浸膏1%，磷酸氫二鉀0.09%，磷酸二氫鉀0.06%，硫酸鎂0.02%，生長因子溶液1%，pH 7.0。其中生長因子溶液配方(w/v):維生素B11%，煙酰胺(VPP)1%，生物素0.0016%。生長因子過濾除菌，其余121℃滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 將冰箱內(nèi)保存的類球紅細菌3757菌株劃線于固體培養(yǎng)基平板上，37℃活化2～3 d，挑選單菌落進一步純化，最后再篩選出單菌落保存于斜面固體培養(yǎng)基上。

1.2.2 種子制備 將活化的類球紅細菌3757接種于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于32℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，得到液體種子。

1.2.3 發(fā)酵制備菌體 按照5%的接種量將液體種子接種到盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于32℃，180 r/min培養(yǎng)40 h，得到發(fā)酵液。取發(fā)酵液于12000 r/min離心10 min，棄上清液，收集菌體，蒸餾水洗滌3次，備用。

1.2.4 研磨法 取菌體0.5 g，加適量石英砂研磨15 min，研磨成勻漿，再用10倍體積的丙酮震蕩30 min。

1.2.5 超聲波法 取菌體0.5 g，加入5 mL丙酮，震蕩混勻后用超聲波粉碎儀進行破壁處理:振幅30%、工作/間隔時間1 min/1 min，超聲波總時間15 min。最后震蕩30 min。

1.2.6 酸溶法 取菌體0.5 g，加入3 mL 2 mol/L鹽酸，于25℃處理20 min，然后在12000 r/min離心10 min，收集菌體，再用10倍體積的丙酮震蕩30 min。

1.2.7 凍融法 取菌體0.5 g，于 －20℃處理2 h后常溫解凍1 h，再用10倍體積的丙酮震蕩30 min。

1.2.8 酸溶輔助超聲波法 先采用酸溶法處理菌體，再綜合采用超聲波法處理。

1.2.9 凍融輔助超聲波法 先采用凍融法處理的菌體，再綜合采用超聲波法處理。

1.2.10 類胡蘿卜素收集 采用不同提取方法提取菌體中類胡蘿卜素后，于12000 r/min離心10 min，收集上清液即為類胡蘿卜素提取液。

1.2.11 類胡蘿卜素測定 參照Gu等［4］方法測定并計算類胡蘿卜素提取率。

1.2.12 單因素實驗 在酸溶輔助超聲波法初始提取條件下，選擇提取溶劑(丙酮、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇)、料液比(1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶15和1∶20)、超聲波總時間(包括工作和間隔時間)(5、10、15、20 和 25 min)、超聲振幅(20%、30%、40%、50%和60%)、超聲工作/間隔時間(1 min/1 min、1 min/2 min、2 min/1 min、2 min/2 min 和 2 min/3 min)、酸濃度(1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.0 mol/L)、酸溶溫度(18、21、24、27 和 30 ℃)、和酸溶時間(5、10、15、20和25 min)作為單因素實驗考察因素，分別考察其對類球紅細菌類胡蘿卜素提取率的影響。

1.2.13 正交實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇合適的因素和水平，進行正交實驗，找出最優(yōu)的因素和水平，得到較高的類胡蘿卜素提取率。

1.2.14 重復(fù)性實驗 在最佳提取工藝條件下進行重復(fù)性實驗，并同優(yōu)化前條件進行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法比較

分別采用超聲波法、研磨法、酸溶法、凍融法、酸溶輔助超聲波法和凍融輔助超聲波法從類球紅細菌類3757菌株中提取胡蘿卜素，以最高提取率為100%，考察不同提取方法對其提取率的影響，結(jié)果見表1?？梢?，酸溶輔助超聲波法提取類胡蘿卜素的效果最好，其提取率是研磨法的1.91倍，是超聲波法的1.32倍，是凍融輔助超聲波法的1.08 倍。

表1 不同提取方法比較Table 1 Comparison of different extraction methods

2.2 提取溶劑的選擇

在酸溶輔助超聲波法初始條件下處理菌體，然后將提取劑丙酮分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇代替，以最高提取率為100%，考察提取溶劑對類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖1。采用不同溶劑提取類胡蘿卜素，其提取效果存在明顯差異，采用丙酮為提取溶劑時類胡蘿卜素的提取率最高，是最低提取率的9.81倍。

圖1 提取溶劑對類胡蘿卜素提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction rate of carotenoid

2.3 料液比

在酸溶輔助超聲波法初始條件下，固定菌體量，改變料液比(菌體質(zhì)量/丙酮體積)分別為1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶15 和 1∶20，以最高提取率為100%，考察料液比對類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖2。隨丙酮用量的增大，細胞濃度降低，有利于細胞破碎，這是因為細胞濃度越高，液體的黏稠度越大，不利于空化泡的形成及其膨脹和爆炸，導(dǎo)致破碎效果較差。但超過最適料液比1∶10后，當丙酮用量再繼續(xù)增大時，破損率降低;這可能是由于丙酮用量越大，超聲波在丙酮液中傳遞的損失也就越大，破碎效果相應(yīng)也就越差［13］。可見，料液比對類胡蘿卜素提取率影響顯著，最適料液比為1∶10。

圖2 料液比對類胡蘿卜素提取率的影響Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on extraction rate of carotenoid

2.4 超聲波總時間

在酸溶輔助超聲波法初始條件下，改變超聲波總時間(包括工作和間隔時間)分別為5、10、15、20和25 min，以最高提取率為100%，考察超聲波總時間對類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖3。隨超聲波總時間的增加，類胡蘿卜素提取率逐漸上升，當超聲波總時間為15 min時，類胡蘿卜素提取率最高，是最低提取率的1.49倍;其后提取率反而降低。這主要是由于破碎時間過長延長了類胡蘿卜素與氧氣、光的接觸時間，導(dǎo)致類胡蘿卜素降解。并且由于作用時間過長使細胞過于粉碎，導(dǎo)致大量蛋白和其他雜質(zhì)被提取出來，增加了后續(xù)提取分離的難度，影響產(chǎn)品的純度［13］?？梢?，超聲波總時間對類胡蘿卜素提取率影響顯著，最適超聲波總時間為15 min。

圖3 超聲波總時間對類胡蘿卜素提取率的影響Fig.3 Effect of total time of ultrasonic treatment on extraction rate of carotenoid

2.5 超聲波振幅

在酸溶輔助超聲波法初始條件下，改變超聲波振幅分別為20%、30%、40%、50%和60%，以最高提取率為100%，考察超聲波振幅對類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖4?？梢姡暡ㄕ穹鶎︻惡}卜素提取率影響不顯著;當超聲波振幅為40%時，類胡蘿卜素提取率最高，是較優(yōu)振幅。

圖4 超聲波振幅對類胡蘿卜素提取率的影響Fig.4 Effect of vibration amplitude of ultrasonic treatment on extraction rate of carotenoid

2.6 超聲波工作/間隔時間

在酸溶輔助超聲波法初始條件下，改變工作/間隔時間分別為1 min/1 min、1 min/2 min、2 min/1 min、2 min/2 min 和2 min/3 min，以最高提取率為100%，考察超聲波工作/間隔時間對類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖5?？梢姡暡üぷ?間隔時間對類胡蘿卜素提取率的影響不顯著;當工作/間隔時間為2 min/1 min時，類胡蘿卜素提取率最高。超聲波通過空化效應(yīng)破碎細胞的過程實際就是空化泡形成、振動、膨脹、壓縮和崩潰閉合的過程，該過程需要一段短暫的時間來完成，短時多次的工作方式能使超聲波產(chǎn)生的空化泡，有足夠的時間和更多機會完成膨脹和爆炸過程，因此有利于細胞的破碎［13］。

圖5 超聲波工作/間隔時間對類胡蘿卜素提取率的影響Fig.5 Effect of work/rest time of ultrasonic treatment on extraction rate of carotenoid

2.7 酸濃度

在酸溶輔助超聲波法初始條件下，改變鹽酸濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.0 mol/L，以最高提取率為100%，考察鹽酸濃度對類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖6。隨鹽酸濃度逐漸增大，類胡蘿卜素的提取率也不斷增加，當鹽酸濃度為2 mol/L時，類胡蘿卜素的提取率最大?？梢?，酸濃度對類胡蘿卜素提取率有明顯影響，較優(yōu)酸濃度為2 mol/L。

圖6 酸濃度對類胡蘿卜素提取率的影響Fig.6 Effect of concentration of HCl treatment on extraction rate of carotenoid

2.8 酸溶溫度

在酸溶輔助超聲波法初始條件下，改變酸溶溫度分別為18、21、24、27和30℃，以最高提取率為100%，考察酸溶溫度對類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖7。隨酸溶溫度的升高，類胡蘿卜素提取率增加，當酸溶溫度達到27℃時，類胡蘿卜素提取率最高，其后提取率又下降?？梢?，酸溶溫度對類胡蘿卜素提取率影響不顯著，最適酸溶溫度為27℃。

圖7 酸溶溫度對類胡蘿卜素提取率的影響Fig.7 Effect of temperature of HCl treatment on extraction rate of carotenoid

2.9 酸溶時間

在酸溶輔助超聲波法初始條件下，改變酸溶時間度分別為5、10、15、20 和 25 min，以最高提取率為100%，考察酸溶時間對類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖8。隨酸溶時間的延長，類胡蘿卜素提取率增加，當酸溶時間為15 min時，提取率最高?？梢?，酸溶時間對類胡蘿卜素提取率有明顯影響，較優(yōu)酸溶時間為15 min。

圖8 酸溶時間對類胡蘿卜素提取率的影響Fig.8 Effect of time of HCl treatment on extraction rate of carotenoid

2.10 正交實驗

單因素試驗發(fā)現(xiàn)，超聲波總時間、料液比、酸濃度和酸溶時間對類胡蘿卜素提取率的影響較顯著。而超聲波振幅、超聲波工作/間隔時間、酸溶溫度對類胡蘿卜素提取率的影響不顯著。故選擇料液比、超聲波總時間、酸濃度和酸溶時間進行四因素三水平正交實驗，實驗設(shè)計見表2，實驗結(jié)果和分析見表3和表4。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

表3 正交實驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test

由表3極差分析可知，各因素對類球紅細菌中類胡蘿卜素提取率的影響從大到小依次為料液比、超聲波總時間、酸濃度和酸溶時間。各因素的最佳組合為A2B3C3D3，即料液比為1∶10，超聲波處理總時間為20 min，酸濃度為3 mol/L，酸溶時間為25 min。方差分析結(jié)果(表4)表明，料液比對類球紅細菌類胡蘿卜素的提取率有顯著影響(P＜0.05)，而超聲波總時間、酸濃度和酸溶時間對類胡蘿卜素的提取率無顯著影響。

表4 正交試驗的方差分析Table 4 Variance analysis of factors in the orthogonal test

綜合單因素和正交實驗結(jié)果，得到酸溶輔助超聲波法提取類球紅細菌類胡蘿卜素的最佳提取工藝條件:料液比1∶10、超聲總時間20 min、酸濃度3 mol/L、酸溶時間25 min、超聲波振幅40%、超聲工作/間隔時間2 min/1 min、酸溶溫度27℃，提取溶劑為丙酮。

2.11 重復(fù)性實驗

在最佳提取工藝條件下做5組重復(fù)試驗，結(jié)果見表5?？梢?，在最優(yōu)提取工藝條件下，相對標準偏差(RSD)為0.72%，試驗的重現(xiàn)性較好，平均提取率為1293.1 μg/g，優(yōu)化前超聲波法初始條件類胡蘿卜素提取率為739.8 μg/g?？梢姡瑑?yōu)化后提取率比優(yōu)化前提高了74.8%。

表5 重復(fù)性實驗Table 5 Duplicated test under optimized extraction conditions

3 討論

采用單因素和正交試驗對類球紅細菌3757產(chǎn)類胡蘿卜素的提取條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明:①采用超聲波法、酸溶法、研磨法、凍融法、酸溶輔助超聲波法和凍融輔助超聲波法從類球紅細菌3757菌株中提取類胡蘿卜素，發(fā)現(xiàn)酸溶輔助超聲波法是較優(yōu)的提取方法;②通過單因素和正交實驗，得到了酸溶輔助超聲波法的最佳提取工藝條件為料液比1∶10、超聲波處理總時間20 min、酸濃度3 mol/L、酸溶時間25 min、超聲波振幅40%、超聲工作/間隔時間2 min/1 min、酸溶溫度27℃，提取溶劑為丙酮;③實驗結(jié)果重現(xiàn)較好。優(yōu)化前超聲波法初始條件的類胡蘿卜素提取率為739.8 μg/g，酸溶輔助超聲波法優(yōu)化后條件的提取率為1293.1 μg/g;優(yōu)化后提取率比優(yōu)化前提高了74.8%。這有利于后續(xù)類球紅細菌類胡蘿卜素的分離純化和結(jié)構(gòu)分析，為其后性質(zhì)和功能研究以及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］孫軍德，曹婧.不同北蟲草菌株產(chǎn)類胡蘿卜素分析［J］.微生物學(xué)雜志，2012，32(3):95-97.

［2］楊世平，吳灶和，簡紀常.沼澤生紅冬孢酵母生長及產(chǎn)類胡蘿卜素培養(yǎng)條件的研究［J］.微生物學(xué)雜志，2011，31(3):61-66.

［3］朱建飛，賴川，唐春紅.紫蘇粕中類胡蘿卜素提取工藝參數(shù)的優(yōu)化［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2011，37(6):689-692.

［4］Gu ZX，Chen DM，Han YB，et al.Optimization of carotenoids extraction from Rhodobacter sphaeroides［J］.LWT，2008，41:1082-1088.

［5］趙婷，林孔亮，惠伯棣.微生物源類胡蘿卜素研究進展［J］.食品科學(xué)，2010，31(23):461-467.

［6］劉卉琳，劉紹，蘭時樂，等.類胡蘿卜素產(chǎn)生菌種的鑒定［J］.微生物學(xué)雜志，2011，31(2):32-35.

［7］Chen DM，Han YB，Gu ZX.Application of statistical methodology to the optimization of fermentative medium for carotenoids production by Rhodobacter sphaeroides［J］.Process Biochemistry，2006，41(8):1773-1778.

［8］薛峰，李晨，潘思軼.動物組織中類胡蘿卜素分析、分布的研究進展［J］.中國糧油學(xué)報，2011，26(5):122-128.

［9］Paschenko VZ，Gorokhov VV，Korvatovskiy BN，et al.The rate of Qx→Qyrelaxation in bacteriochlorophylls of reaction centers from Rhodobacter sphaeroides determined by kinetics of the ultrafast carotenoid bandshift［J］.Biochimica et BiophysicaActa，2012，1817:1399-1406

［10］趙凱，于影，姜丹，等.1株類球紅細菌及其降解敵敵畏的特性［J］.環(huán)境科學(xué)，2009，30(4):1119-1204.

［11］Italiano F，D＇Amici GM，Rinalducci S，et al.The photosynthetic membrane proteome of Rhodobacter sphaeroides R-26.1 exposed to cobalt［J］.Research in Microbiology，2011，162(5):520-527.

［12］胡煒東，蔡永敏，楊俊峰.超聲波輔助提取油莎豆油工藝的研究［J］.食品與機械，2013，29(2):109-112，129.

［13］李聚海，岳田利，袁亞宏.輔酶Q10超聲波破碎法提取工藝條件研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007，35(5):207-211.