γ-Fe2O3-凹土超順磁性納米復(fù)合材料固載豬胰脂肪酶

胡集鋮，王 歡，李 亞，韓萍芳

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 211800)

脂肪酶因其催化反應(yīng)的高效性［1-2］、高立體選擇性［3］、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)備受關(guān)注。然而，游離酶穩(wěn)定性差、反應(yīng)后難以與產(chǎn)品分離、不易重復(fù)利用，這些缺點(diǎn)制約了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。為了提高其穩(wěn)定性和利用效率，酶的固定化逐漸成為酶工程研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。固定化酶的性能主要取決于固定化方法和所使用的載體材料。目前，制備固定化酶的方法主要有吸附法、共價(jià)法、交聯(lián)法、包埋法等，其中吸附法因操作簡(jiǎn)便、條件溫和，不會(huì)引起酶失活被廣泛使用。理想的載體則應(yīng)具備良好的機(jī)械強(qiáng)度、熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性等特點(diǎn)，如二氧化硅［4-6］、多糖類［7-9］、高分子納米纖維［10-13］、納米粒子［14-15］等材料已被成功地用于固定化酶。

作為一類純天然的礦物材料，硅酸鹽黏土因具有價(jià)格低廉、比表面積大、孔隙率高、良好的吸附性和生物親和性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于吸附固定化酶。但是，凹土等傳統(tǒng)載體固定化酶仍然存在從反應(yīng)體系中分離較為復(fù)雜的缺點(diǎn)。對(duì)傳統(tǒng)載體進(jìn)行功能化修飾是目前克服該缺點(diǎn)的理想方案之一，如磁性復(fù)合載體的制備與應(yīng)用。一方面，在外加磁場(chǎng)作用下，可以使固定化酶簡(jiǎn)單地從反應(yīng)體系分離;另一方面，外部磁場(chǎng)使固定化酶的運(yùn)動(dòng)方式和方向得到控制，替代傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌，可以提高固定化酶的催化效率。

筆者通過制備γ-Fe2O3-凹土超順磁性納米復(fù)合材料(γ-Fe2O3-ATP)，并將其用于豬胰脂肪酶的固定化，考察酶固定化條件及固定化酶的性質(zhì)，以期為其在工業(yè)化方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

豬胰脂肪酶(PPL，BR)，南京奧多福尼生物技術(shù)有限責(zé)任公司;凹凸棒石黏土(以下簡(jiǎn)稱“凹土”)，江蘇澳特邦非金屬礦業(yè)有限公司;NaHCO3、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH(均為AR)，廣東汕頭西隴化工廠;FeCl3·6H2O(AR)、聚乙烯醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;橄欖油(化學(xué)純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;冰醋酸(AR)，上海申博化工有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DSHZ-300A型恒溫振蕩器，太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠;GL-21M型離心機(jī)，上海離心機(jī)械研究所;752紫外-可見光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;開啟管式電阻爐，山東省龍口市先科儀器公司;H-800透射電子顯微鏡，日本日立公司;ASAP2010全自動(dòng)比表面積及孔徑分布測(cè)定儀，美國(guó)Micromeritics公司;振動(dòng)試樣磁強(qiáng)計(jì)，Lakeshore Cryotronic公司。

1.3 γ-Fe2O3-ATP的制備與表征

γ-Fe2O3-ATP的制備方法參照文獻(xiàn)［16］的方法:配制0.02 mol/L FeCl3·6H2O溶液，調(diào)節(jié) pH至2.5并室溫?cái)嚢? h，再將其緩慢逐滴加到凹土懸浮液中并不斷攪拌，離心得到 Fe3+-ATP，水洗至無Cl-，室溫真空干燥后，研磨成粉末。將試樣粉末暴露于80℃ 冰醋酸蒸氣中，熏蒸3 h后暴露于相同溫度的空氣中幾分鐘，去除表面吸附的冰醋酸，得到FeAc3-ATP。在N2保護(hù)下400℃煅燒1 h后，即得到磁性試樣γ-Fe2O3-ATP。

透射電子顯微鏡(TEM)表征:將制備好的γ-Fe2O3-ATP用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察，研究其表面形貌特征。

比表面積和孔徑分布測(cè)定:通過ASAP2010全自動(dòng)比表面積及孔徑分布測(cè)定儀測(cè)定γ-Fe2O3-ATP的比表面積和平均孔徑。

磁性能測(cè)定:將γ-Fe2O3-ATP在室溫下通過振動(dòng)試樣磁強(qiáng)計(jì)測(cè)定其飽和磁化強(qiáng)度。

1.4 脂肪酶的固定化

向100 mL具塞三角燒瓶中加入2 mg/mL酶液40 mL、γ-Fe2O3-ATP 80 mg，在 25 ℃、110 r/min恒溫水浴振蕩器中固定一定時(shí)間以后，取出三角燒瓶，利用外加磁場(chǎng)使上清液和固定化酶分離。上清液中蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定，其減少的蛋白質(zhì)量即為γ-Fe2O3-ATP上所固載的脂肪酶含量。

固載上的酶蛋白量與載體量的比例可以由式Pa=(ρi-ρf)V/m 計(jì)算得出。

式中:Pa為每克載體上固載的酶蛋白的量，mg/g;ρi和ρf分別為反應(yīng)前和反應(yīng)后酶溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL;V為反應(yīng)液體積，mL;m為使用的載體的質(zhì)量，g。

1.5 脂肪酶活力的測(cè)定

脂肪酶活力的測(cè)定以橄欖油為底物，采用直接酸堿滴定法［17-18］。一個(gè)酶活力單位(U)定義為在溫度為37℃的條件下，1 h從橄欖油中水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 γ-Fe2O3-ATP的表征

2.1.1 透射電子顯微鏡(TEM)表征

圖1為制備好的γ-Fe2O3-ATP用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察的結(jié)果。由圖1可知:凹土呈棒狀，γ-Fe2O3呈黑色球狀，平均粒徑為 10 nm，γ-Fe2O3粒子分布在凹土外表面上。這種分布原因可能是凹土表面存在一些負(fù)電荷和一些暴露出來的可交換的Al3+、Mg2+等陽(yáng)離子，F(xiàn)e3+通過靜電作用和凹土的離子交換性質(zhì)結(jié)合在凹土表面，經(jīng)過醋酸熏蒸形成醋酸鐵，煅燒后與凹土形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)覆蓋在其表面。

圖1 γ-Fe2O3-ATP透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 TEM images of superparamagnetic γ-Fe2O3-attapulgite nanocomposites

2.1.2 N2等溫吸附-脫附(BET)表征

γ-Fe2O3-ATP等溫吸附-脫附曲線為 Langmuir IV型曲線(圖2)。由圖2可知:在相對(duì)壓力達(dá)到0.5左右時(shí)，吸附等溫線和脫附等溫線開始不重合，出現(xiàn)了H3型的滯后環(huán)，說明載體中存在介孔。經(jīng)測(cè)定γ-Fe2O3-ATP的平均孔徑為10.862 nm與豬胰脂肪酶尺寸相似，使得脂肪酶很容易進(jìn)入其孔道中。γ-Fe2O3-ATP有較高的比表面積為102.63 m2/g ，較 Zhao等［19］化學(xué)法合成的48.5 m2/g高，使得固載率提高。

圖2 γ-Fe2O3-ATP吸附-脫附等溫曲線Fig.2 N2adsorption-desorption isotherms of superparamagnetic γ-Fe2O3-attapulgite nanocomposites

2.1.3 振動(dòng)試樣磁強(qiáng)計(jì)(VSM)表征

圖3為γ-Fe2O3-ATP在室溫下表現(xiàn)出超順磁性特征結(jié)果。由圖3可知:當(dāng)外界有磁場(chǎng)時(shí)載體能夠迅速被磁化且有較強(qiáng)磁性，當(dāng)外界磁場(chǎng)消失時(shí)載體的磁性能夠迅速隨之消失。這種性質(zhì)有利于載體從反應(yīng)介質(zhì)中分離，載體不會(huì)因磁化而團(tuán)聚，有利于載體的重新分散。經(jīng)測(cè)定，γ-Fe2O3-ATP的飽和磁化強(qiáng)度為8.915 emu/g，較 Bourlinos等［16］磁性蒙脫土1.75 emu/g高，能夠迅速響應(yīng)外界磁場(chǎng)，使得γ-Fe2O3-ATP在使用過程中易于在外界磁場(chǎng)的作用下分離，這一點(diǎn)對(duì)固定化酶的回收和重復(fù)利用極為重要。

圖3 γ-Fe2O3-ATP磁滯回線Fig.3 Magnetic hysteresis loop of superparamagnetic γ-Fe2O3-attapulgite nanocomposites

2.2 脂肪酶固定化條件的研究

2.2.1 固定化時(shí)間的確定

圖4是在pH 7.0的磷酸緩沖液中考察固載時(shí)間對(duì)固定化酶活的影響結(jié)果。由圖4可知:在4 h之前酶活和固載率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)時(shí)間為4 h時(shí)酶活和固載率都達(dá)到最大。豬胰脂肪酶分子與γ-Fe2O3-ATP可能是通過范德華力、疏水作用相結(jié)合，在載體表面和孔道形成單分子層吸附，使得酶的活性中心能夠充分暴露出來，表現(xiàn)出較大的酶活［20］。4 h之后，酶活和固載率隨時(shí)間延長(zhǎng)下降?？赡芤环矫媸侵久概c載體之間僅通過微弱的物理作用相結(jié)合，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間搖床固載后，使其又回到溶液中去，導(dǎo)致酶活下降。另一方面可能是因?yàn)楣梯d環(huán)境不是無菌的，固載后期酶液中有H2S的氣味即是被細(xì)菌分解所致。

圖4 時(shí)間對(duì)酶固定化的影響Fig.4 Effects of time on PPL immobilization on γ-Fe2O3-ATP

2.2.2 體系pH的確定

圖5是在其他條件不變的情況下，考察體系pH對(duì)固定化酶活的影響結(jié)果。由圖5可知:當(dāng)pH為6.0時(shí)酶活和固載率最大，在pH值超過7.0后酶活和固載率急劇下降。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在溶液中有兩性電離現(xiàn)象，當(dāng)溶液pH值低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電，反之蛋白質(zhì)帶負(fù)電。載體孔道內(nèi)表面由于帶有負(fù)電荷使其pH值比溶液中?。?1］。PPL 的等電點(diǎn)為 5.0［22］。當(dāng)溶液的 pH 在5.0～6.0之間時(shí)，由于載體孔道內(nèi)表面的pH值比溶液小，所以孔道內(nèi)的脂肪酶帶正電荷并隨著pH的增加而逐漸減少為零，酶分子之間的庫(kù)倫力隨之變?nèi)?，在載體的內(nèi)表面形成較緊密的單層排列［23］，在溶液pH為6.0時(shí)，可能是酶分子所帶電荷為0，酶分子之間斥力為0，酶活和固載率最高。當(dāng)pH在6.0～9.0之間時(shí)，可能是載體孔道pH大于酶分子等電點(diǎn)，酶分子帶負(fù)電荷，脂肪酶和載體內(nèi)表面都帶負(fù)電荷而相互排斥，固載率下降，酶活變低［20］。

圖5 pH對(duì)酶固定化的影響Fig.5 Effects of pH on PPL immobilization on γ-Fe2O3-ATP

2.3 固定化酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 固定化酶的熱穩(wěn)定性

圖6是將制備好的固定化酶和游離酶放置60℃環(huán)境中考察高溫對(duì)酶活的影響結(jié)果，并以各自未經(jīng)熱處理的初始酶活力為100%計(jì)。由圖6可知:隨著在60℃高溫環(huán)境下時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化酶和游離酶的酶活都呈下降趨勢(shì)，經(jīng)過6 h高溫保存后固定化酶保留初始酶活的52%，游離酶保留初始酶活的19%，固定化酶的剩余酶活高于游離酶，表明固定化酶有更好的熱穩(wěn)定性。推測(cè)原因可能是部分脂肪酶進(jìn)入材料的介孔中使得其在高溫中空間構(gòu)象得到孔道的束縛，酶活力得以保留。

圖6 高溫對(duì)固定化酶和游離酶的影響Fig.6 Effects of temperature on stability of immobilized lipase

2.3.2 固定化酶的重復(fù)利用性

在pH 7.0、溫度37℃的條件下，考察固定化酶的重復(fù)利用效果，結(jié)果見圖7。由圖7可知:隨著使用次數(shù)的增加酶活有所下降，在重復(fù)使用5次后比酶活仍達(dá)6000 U/g。原因一方面可能是利用了載體的磁性特點(diǎn)回收固定化酶避免了其他方法回收過程中的損失，另一方面可能是固定化酶機(jī)械強(qiáng)度較游離酶高，使其穩(wěn)定性提高。酶活有所下降可能是酶分子與γ-Fe2O3-ATP僅通過微弱的疏水作用和范德華力結(jié)合的，經(jīng)過多次分離洗滌，酶分子很容易脫落，造成酶活部分損失，但每次能回收完全且方便，所以就固定酶自身而言，其重復(fù)利用性能很理想。

圖7 使用次數(shù)對(duì)固定化酶的影響Fig.7 Reusability of immobilized lipase

3 結(jié)論

以自制γ-Fe2O3-ATP作為固定化豬胰脂肪酶的載體，其固定化最佳條件為固定化時(shí)間4 h及pH 6.0。制備的γ-Fe2O3-ATP比表面積為102.63 m2/g，發(fā)現(xiàn)能提高其固載率。其飽和磁化強(qiáng)度為8.915 emu/g，對(duì)外界磁場(chǎng)響應(yīng)更靈敏，能更好地解決傳質(zhì)及回收再利用問題。由此表明γ-Fe2O3-ATP是固定化酶的良好載體。由于保留了凹土的骨架結(jié)構(gòu)，γ-Fe2O3-ATP仍然具有凹土的性質(zhì)，可通過改性派生出各類衍生物，具有較好的應(yīng)用前景。

［1］Bornadel A，Hatti-Kaul R，S?rensen K，et al.Optimization of a two-step process comprisinglipase catalysis and thermal cyclization improves the efficiency of synthesis of six-membered cyclic carbonate from trimethylolpropane and dimethylcarbonate［J］.Biotechnol Prog，2013，29(1):66-73.

［2］Panizza P，Syfantou N，Pastor F I J，et al.Acidiclipase Lip I.3 from a Pseudomonas fluorescens-like strain displays unusual properties and shows activity on secondary alcohols［J］.J Appl Microbiol，2013，114(3):722-732.

［3］Vijayakumar K R，Gowda L R.Rice(Oryza sativa)lipase:molecular cloning，functional expression and substrate specificity［J］.Protein Expr Purif，2013，88(1):67-79.

［4］Zhao D Y，Huo Q S，F(xiàn)eng J L，et al.Nonionic triblock and star diblock copolymer and oligomeric surfactant syntheses of highly ordered，hydrothermally stable，mesoporous silica structures［J］.J Am Chem Soc，1998，120:6024-6036.

［5］Schmidt-Winkel P，Lukens W W，Zhao D Y，et al.Mesocellular siliceous foams with uniformly sized cells and windows［J］.J Am Chem Soc，1999，121:254-255.

［6］Jie L，Jie F，Yu C Z，et al.Immobilization of enzymes in mesoporous materials:controlling the entrance to nanospace［J］.Microporous Mesoporous Mater，2004，73(3):121-128.

［7］Kurita K，Yoshino H，Nishimura S，et al.Mercapto-chitins:a new type of supports for effective immobilization of acid phosphatase［J］.Carbohydr Polym，1997，32:171-175.

［8］曹國(guó)民，王釩，宋國(guó)強(qiáng)，等.交聯(lián)烯丙基葡聚精凝膠固定化脂肪酸的研究［J］.離子交換與吸附，1997(5):515-518.

［9］姜泓海，鄒漢法，汪海林，等.復(fù)合纖維素膜固定化胰蛋白酶反應(yīng)器及其應(yīng)用于蛋白質(zhì)酶解［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2000，21(5):702-706.

［10］Seng B L，Cho I，Rhee J S，et al.Properties of penicillin amidohydrolase immobilized nylon fiber［J］.Bull Korean Chem Soc，1980，l(1):10-17.

［11］Grasset L，Cordier D，Vllie A.Silk:a natural protein for enzyme immobilization［J］.Process Biochem，1979，14(8):2-5.

［12］Toldra F，Jansen N B，Tsao G T.Use of porous glass fiber as a support for biocatalyst immobilization［J］.Biotechnol Lett，1986，8(11):785-790.

［13］Malcata F X，Reyes H R，Gacia H S，et al.Kinetics and mechanisms of reactions catalysed by immobilized lipases［J］.Enzyme Microb Technol，1992，14(6):426-446.

［14］Jia H，Zhu G，Wang P.Catalytic behaviors of enzymes attached to nanoparticles:the effect of particle mobility［J］.Biotechnol Bioeng，2003，84(4):406-414.

［15］Daubresse C，Grandfils C，Jérome R，et al.Enzyme immobilization in reactive nanoparticals produced by inverse microemulsion polymerization［J］.Colloid Polym Sci，1996，274:482-489.

［16］Bourlinos A B，Karakassides M A，Simopoulos A，et al.Synthesis and characterization of magnetically modified clay composites［J］.Chem Mater，2000，12(9):2640-2645.

［17］中華人民共和國(guó)輕工業(yè)部食品工業(yè)司.QB/T 1803-1993 工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法［S］.北京:北京輕工業(yè)出版社，1993.

［18］高貴，韓四平，王智，等.脂肪酶活力檢測(cè)方法的比較［J］.藥物生物技術(shù)，2002，9(5):281-284.

［19］Zhao G H，Wang J Z，Li Y F，er al.Enzymes immobilized on superparamagnetic Fe3O4@Clays nanocomposites:preparation，characterization，and a new strategy for the regeneration of supports［J］.J Phys Chem C，2011，115:6350-6359.

［20］Katiyar A，Ji L，Smirniotis P，et al.Protein adsorption on the mesoporous molecular sieve silicate SBA-15:effects of pH and pore size［J］.J Chromatogr A，2005，1069(1):119-126.

［21］O'Reilly J P，Butts C P，IAnson I A，et al.Interfacial pH at an isolated silica-water surface［J］.J Am Chem Soc，2005，127:1632-1633.

［22］Fan J，Yu C，Wang L，et al.Mesotunnels on the silica wall of ordered SBA-15 to generate three-dimensionallarge-pore mesoporous networks［J］.J Am Cheml Soc，2001，123:12113-12114.

［23］Vinu A，Murugesan V，Tangermann O，et al.Adsorption of cytochrome c on mesoporous molecular sieves:influence of pH，pore diameter，and aluminum incorporation［J］.Chem Mater，2004，16:3056-3065.