木聚糖酶發(fā)酵工藝在50 L罐中的放大

陸 彬，萬(wàn)紅貴

(1.江蘇同凱兆豐生物科技有限公司南京,211800；2.南京工業(yè)大學(xué)江蘇省工業(yè)生物技術(shù)創(chuàng)新中心南京,211800)

木聚糖酶發(fā)酵工藝在50 L罐中的放大

陸 彬1，萬(wàn)紅貴2

(1.江蘇同凱兆豐生物科技有限公司南京,211800；2.南京工業(yè)大學(xué)江蘇省工業(yè)生物技術(shù)創(chuàng)新中心南京,211800)

自制的酵母水解液成功替代有機(jī)N源酵母浸膏被應(yīng)用于木聚糖酶發(fā)酵，大大降低了原料成本。在此基礎(chǔ)上，于50 L罐中進(jìn)行發(fā)酵工藝放大，得到最佳發(fā)酵條件：攪拌轉(zhuǎn)速220 r/min、空氣流量23 L/min、初始pH 5.5、溫度30 ℃、罐壓0.04 MPa，最終發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶水平可達(dá)到2 864 U/mL，用箭葉圓盤渦輪攪拌槳代替上層平葉圓盤渦輪攪拌槳，產(chǎn)酶水平無顯著變化，攪拌功率節(jié)約11%。

發(fā)酵；畢赤酵母；放大；木聚糖酶

木聚糖酶是將木聚糖分解成低聚糖和木糖的酶系，被廣泛應(yīng)用于造紙、紡織、飼料、食品和醫(yī)藥等行業(yè)[1-4]。生產(chǎn)木聚糖酶的微生物有很多，如曲霉屬、木酶屬和鏈酶屬等，隨著基因工程的發(fā)展，利用基因重組技術(shù)來生產(chǎn)木聚糖酶已逐漸成為熱點(diǎn)[5-6]。我國(guó)對(duì)木聚糖酶的研究集中于對(duì)菌株的改造，仍停留在搖瓶尺度上的優(yōu)化和篩選，關(guān)于其產(chǎn)業(yè)化的研究比較少。

筆者主要研究木聚糖酶在產(chǎn)業(yè)化中所遇到的問題，包括原料價(jià)格成本、發(fā)酵工藝的優(yōu)化放大(如攪拌轉(zhuǎn)速、空氣流量)及攪拌器類型的選擇等，以期為木聚糖酶的放大積累經(jīng)驗(yàn)，將來在較短的時(shí)間以較低的成本實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 菌種

所用菌種為產(chǎn)木聚糖酶畢赤酵母，由南京工業(yè)大學(xué)菌種保藏室提供。

1.2 儀器及材料

樺木木聚糖購(gòu)自Sigma公司;3,5-二硝基水楊酸(DNS)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;廢啤酒酵母水解液，參照文獻(xiàn)[7]自制；其他試劑為食用級(jí)或工業(yè)級(jí)。

初始種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、酵母膏10、蛋白胨20，121 ℃滅菌30 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：麥麩200、酵母膏40、吐溫-80 2，121 ℃滅菌30 min。

50 L發(fā)酵罐為南京新凱龍生物工程有限公司提供。

1.3 酶活的測(cè)定

采用DNS法，參照文獻(xiàn)[8]。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 種子培養(yǎng)

取培養(yǎng)斜面1支，用無菌水沖洗出來，通過火焰接種法接入5 L罐中，通過搖瓶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)種子和發(fā)酵的培養(yǎng)條件基本相同，故采用5 L罐的發(fā)酵培養(yǎng)條件來培養(yǎng)種子[9]。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)

種子液以10%的接種量壓入50 L發(fā)酵罐，初始pH為5.5，在30 ℃培養(yǎng)18 h 后流加甲醇。

1.5 原料替代

酵母浸膏在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量很高，其市場(chǎng)均價(jià)在20 000元/t左右，將造成原料成本過大，并且酵母浸膏因廠家和生產(chǎn)工藝的不同，質(zhì)量也有差異，易造成發(fā)酵不穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)采購(gòu)的啤酒酵母進(jìn)行酸水解用以制備酵母水解液[7]，取代酵母浸膏。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的水解液在低pH下可長(zhǎng)時(shí)間保存，發(fā)酵時(shí)用CaO代替NaOH溶液調(diào)解pH，一方面可以降低成本，另一方面能中和產(chǎn)生的CaSO4，可以保持發(fā)酵液鹽濃度的穩(wěn)定。

設(shè)置水解液的質(zhì)量濃度分別為75、82、89、96 g/L在5 L罐中進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵80 h后每隔4 h取樣，根據(jù)酶活最大原則確定最優(yōu)替代濃度和發(fā)酵時(shí)間。

1.6 攪拌轉(zhuǎn)速的放大和優(yōu)化

根據(jù)不同的放大原則，計(jì)算的轉(zhuǎn)速也不同，首先根據(jù)不通氣條件下等體積功率進(jìn)行放大，按式(1)[10]計(jì)算，得出轉(zhuǎn)速為242 r/min；如根據(jù)發(fā)酵液最大線速度相等的原則按式(2)[10]進(jìn)行放大，則運(yùn)算出的轉(zhuǎn)速為167 r/min。 設(shè)計(jì)4組實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化，分別為160、190、220、250 r/min。

(1)

S1=S2=πD1N1=πD2N2

(2)式(1)和(2)中：P1和P2為攪拌功率,W;V1和V2為裝料體積,m3;K為功率常數(shù)因子;D1和D2為攪拌直徑,m；N1和N2為攪拌轉(zhuǎn)速,r/s；S1和S2為攪拌器末端線速度,m/min;ρ為流體密度,kg/m3。

1.7 通氣流量的放大和優(yōu)化

空氣流量若根據(jù)單位體積流量相等的原則進(jìn)行放大，則空氣流量根據(jù)式(3)計(jì)算為30 L/min，如根據(jù)單位為面積通量相等的原則按式(4)計(jì)算，則為9.3 L/min。因此設(shè)計(jì)4組實(shí)驗(yàn)對(duì)流量進(jìn)行優(yōu)化，分別為9、16、23、30 L/min。

Q1/V1=Q2/V2

(3)

Q1/[π/(D1/2)]2=Q2/[π/(D1/2)]2

(4)

式中：Q1和Q2為通氣流量，L/min。

1.8 攪拌器的節(jié)能組合

引入軸流攪拌器，對(duì)降低能耗和改善軸向混合能力進(jìn)行探索，為后續(xù)放大積累經(jīng)驗(yàn)。底層攪拌采用六平葉渦輪攪拌器，上層攪拌分別采用三葉螺旋槳和六箭葉圓盤渦輪攪拌器。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳酵母水解液添加量的實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.5安排實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 水解液含量對(duì)木聚糖酶發(fā)酵的影響Table 1 Effects of hydrolysate concentration on xylanase fermentation

由表1可知：用82 g/L酵母水解液替代40 g/L的酵母浸膏產(chǎn)酶最高，達(dá)到2 816 U/mL，發(fā)酵時(shí)間比使用酵母浸膏提前14 h[9]。這可能是因?yàn)樗崴饨湍副让杆飧鼜氐?，水解液中含有的游離氨基酸、小肽等小分子更多，更易被畢赤酵母快速利用。

啤酒酵母粉市場(chǎng)價(jià)格在4 000～6 000元/t，而每噸酵母粉能生產(chǎn)7 t左右的水解液，加上其他輔助材料，每噸啤酒酵母水解液的成本為700～1 000元，因此取代后，有機(jī)N源的原料成本可節(jié)約90%以上。

2.2 5 L攪拌罐中畢赤酵母的生長(zhǎng)曲線

酵母水解液取代種子培養(yǎng)基中的酵母浸膏，按1.4.1方式培養(yǎng)，結(jié)果見圖1。

圖1 5 L罐中種子生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of seed in 5 L fermenter

圖1中顯示，在5 L罐中，種子在8 h左右進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，在19 h減緩，過了20 h后增速大幅下降，A600也超過了30，因此選用20 h左右接種。

2.3 攪拌轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

根據(jù)1.4.2所述的條件，在通氣量1∶1條件下進(jìn)行優(yōu)化轉(zhuǎn)速，結(jié)果見表2。

表2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)木聚糖酶發(fā)酵的影響Table 2 Effects of stirring speed on xylanase fermentation

由表2可知：轉(zhuǎn)速在220 r/min時(shí)的酶活最高，即最佳攪拌轉(zhuǎn)速高于依攪拌末端線速度相等計(jì)算的攪拌轉(zhuǎn)速，而低于并且較接近于無通氣條件下的單位體積攪拌功率相等而計(jì)算的攪拌轉(zhuǎn)速，因此在更大級(jí)別上的優(yōu)化將依據(jù)后者進(jìn)行放大。

2.4 空氣流量的優(yōu)化

在攪拌轉(zhuǎn)速為220 r/min條件下進(jìn)行通氣量?jī)?yōu)化，結(jié)果見表3。

表3 通氣速率對(duì)木聚糖酶發(fā)酵的影響Table 3 Effects of ventilation rate on xylanase fermentation

由表3可知：通氣量在23 L/min條件下，發(fā)酵酶活最高為2 864 U/mL，在此條件下的泡沫產(chǎn)生量少。通氣比由5 L玻璃罐中的1∶1下降到0.77∶1[9]，可能與反應(yīng)器的高度增加有關(guān)，另一方面50 L或以上發(fā)酵罐為了達(dá)到更好的無菌要求，罐內(nèi)都會(huì)保持0.04 MPa左右的壓力，壓力的提高有助于增加氧在發(fā)酵液中的溶解度，從而提高溶氧。

2.5 攪拌器的節(jié)能組合

按照1.8所述的攪拌器組合進(jìn)行試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)上層采用三葉螺旋型攪拌槳時(shí)，發(fā)酵液液面大幅升高，雖然降低了功率，但裝液系數(shù)大幅下降；而采用箭葉渦輪攪拌器，液面升高不明顯，攪拌功率由0.41 kW 降低到0.36 kW，連續(xù)發(fā)酵兩罐，發(fā)酵酶活分別為2 858和2 876 U/mL，與原發(fā)酵單位無顯著差別。

3 結(jié) 論

在50 L發(fā)酵罐上對(duì)畢赤酵母產(chǎn)木聚糖酶進(jìn)行放大，為將來大規(guī)模的放大和生產(chǎn)提供經(jīng)驗(yàn)上的指導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)也表明攪拌轉(zhuǎn)速易采用等體積功率進(jìn)行放大，然后逐步降低轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化，通氣量隨著液位的升高和罐中壓力增大可適當(dāng)降低。

筆者采用啤酒酵母水解液代替微生物專用級(jí)的酵母浸膏，使有機(jī)N源的原料成本降低90%以上，而攪拌器組合的改變，可以節(jié)省攪拌功率11%。由于條件限制，在攪拌器節(jié)能上的組合實(shí)驗(yàn)還有所欠缺，鑒于軸向攪拌器在節(jié)能上的巨大優(yōu)勢(shì)，當(dāng)條件適合時(shí)，還是值得嘗試的，這將成為低碳節(jié)能中一個(gè)新的研究方向。

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(責(zé)任編輯 周曉薇)

Scale-up of procedure for xylanase fermentation in 50 L fermenter

LU Bin1，WAN Honggui2

(1.Jiangsu Tong Kai Zhao Feng Biotechnology Co.,Ltd,Nanjing 211800,China;2.Jiangsu Provincial Innovation Center for Industrial Biotechnology,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Yeast hydrolysate was used instead of yeast extract as organic nitrogen source in xylanase fermentation,thus reducing the raw material costs.Scale-up of the fermentation in 50 L fermenter was investigated.The optimal conditions of stirring rate,ventilation,initial pH,temperature, and tank pressure were 220 r/min,23 L/min,5.5,30 ℃ and 0.04 MPa,respectively.The yield of xylanase reached 2 864 U/mL.Taking arrow leaf disc turbine agitator in place of flat leaf disc turbine agitator at the front of agitator shaft,the yield of xylanase had no significant change,but stirring power had declined by 11%.

fermentation;Pichiapastoris;scale-up;xylanase

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.012

2012-09-13

陸 彬(1982—)，男，安徽亳州人，工程師，研究方向：生物制品的發(fā)酵及提??；E-mail:lu_bin1982@126.com

TQ925

A

1672-3678(2014)02-0063-03