Ag-SiO2核殼型納米粒的制備及其抗菌作用

陸 露，鄭麗屏，趙培飛，王劍文

(1.蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 藥學(xué)院，蘇州 215123;2.蘇州大學(xué) 金螳螂建筑與城市環(huán)境學(xué)院，蘇州 215123;3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝作物研究所，昆明 650205)

金屬-無機(jī)納米核殼復(fù)合材料因同時(shí)具有納米粒徑和復(fù)合組分，被廣泛應(yīng)用于傳感器、催化、信息存儲(chǔ)、抗體檢測(cè)、涂料、農(nóng)業(yè)及植物研究等領(lǐng)域［1-3］。通過制備Ag-SiO2核-殼型納米粒，可以在提高核心農(nóng)藥物質(zhì)穩(wěn)定性的同時(shí)，發(fā)揮緩釋核心物質(zhì)的效果［4］。Ag-SiO2核殼型納米粒以 SiO2殼層包裹 Ag+，可有效屏蔽內(nèi)核Ag+的相互作用，得到單分散的核殼顆粒，其外層SiO2具有良好的生物相容性和多孔結(jié)構(gòu)，保持了Ag+的化學(xué)活性和催化活性。同時(shí)，細(xì)菌對(duì) Ag+不易產(chǎn)生耐藥性［5］，是一種長(zhǎng)效抗菌劑［6］。Kim 等［7］于2007 年發(fā)現(xiàn) Ag-SiO2核殼型納米粒具有較好的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)作用。Zheng等［8］的研究表明:Ag-SiO2核殼型納米粒對(duì)6種植物病原真菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，但有關(guān)Ag-SiO2核殼型納米粒抗病原真菌的過程和機(jī)制研究則少見報(bào)道。

香石竹枯萎病是由鐮刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.dianthi，race 2)侵染所致的土傳病害，是對(duì)香石竹最嚴(yán)重的病害之一，在世界各香石竹種植區(qū)均有發(fā)生［9］。此病在我國(guó)各香石竹種植區(qū)亦有普遍發(fā)生，危害較重，昆明地區(qū)一般發(fā)病率為10% ～30%，重者達(dá)70% ～80%［10］，因此，亟須應(yīng)用新的防治方法。筆者在前期研究的基礎(chǔ)上，采用改進(jìn)的St?ber法制備 Ag-SiO2復(fù)合納米顆粒［11］，并對(duì)復(fù)合納米顆粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，研究Ag-SiO2納米懸浮液對(duì)鐮刀菌菌絲、孢子生長(zhǎng)的抑制及對(duì)真菌抗氧化酶的影響，初步探討了Ag-SiO2核殼型納米粒的抑菌機(jī)制，以期為Ag-SiO2核殼型納米粒的抗菌應(yīng)用，以及為香石竹枯萎病的防治提供納米抗菌技術(shù)的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

香石竹鐮刀菌2號(hào)生理小種(Fusarium oxysporum f.sp.dianthi，race 2)由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供。

1.2 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)均采用馬鈴薯固體培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱PDA)和馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱 PD)。AgNO3、溴化十六烷基三甲銨(CTAB)、氨水、乙醇與正硅酸四乙酯等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 Ag-SiO2納米粒的制備

Ag-SiO2納米粒的制備參考文獻(xiàn)［11］的方法，略作修改。將0.145 g CTAB溶于180 mL去離子水，加熱并磁力攪拌使其充分溶解，加入0.1 mol/L的AgNO3溶液10 mL，于5 min內(nèi)加入5 mmol/L抗壞血酸溶液10 mL，繼續(xù)攪拌30 min，加入30%(體積分?jǐn)?shù))氨水至pH約為6。加入50 mL無水乙醇與1 mL正硅酸四乙酯，室溫繼續(xù)攪拌4 h。將產(chǎn)物經(jīng)中速定性濾紙過濾，去離子水與無水乙醇洗滌，經(jīng)121℃、25 min高壓蒸氣滅菌后，置于烘箱100℃烘干。

1.4 納米粒的分析與表征

采用日本Shimadzu公司UV2401-PC紫外-可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)300～500 nm范圍內(nèi)掃描，通過觀察銀的特征吸收峰變化來判斷反應(yīng)過程中的具體變化。采用荷蘭 Philips-FEI公司 XL30 ESEMTMP環(huán)境掃描電鏡觀察Ag-SiO2納米粒的形貌、尺寸及分散情況;采用美國(guó)PSS公司的380ZLS型粒徑和電位分析儀測(cè)定粒徑大小。

1.5 抑菌作用的測(cè)定

采用杯碟法測(cè)定Ag-SiO2納米粒對(duì)鐮刀菌的抑制作用［12］。將Ag-SiO2納米粒用PD液體培養(yǎng)基分別稀釋成 0、2、4、8、16、32、64 和 128 μg/mL，備用。取15 mL滅菌后的PDA培養(yǎng)基置于直徑9 cm培養(yǎng)皿中，作為下層培養(yǎng)基，再將10 mL含有105個(gè)/mL鐮刀菌的PDA培養(yǎng)基均勻覆蓋在冷卻后的下層PDA培養(yǎng)基上，靜置冷卻1 h。而后在每塊平板上放置4個(gè)牛津杯(直徑0.6 cm，高1.0 cm)，分別向每個(gè)牛津杯內(nèi)加入100 μL不同濃度Ag-SiO2納米粒懸浮液，水平放置直到液體完全滲透到培養(yǎng)基中。將處理后的平板置于(28±1)℃培養(yǎng)箱中，以PD液體培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)3 d后觀察抑菌效果。

1.6 菌絲和孢子生長(zhǎng)的顯微觀察

取15 mL滅菌后的PDA培養(yǎng)基置于9 cm培養(yǎng)皿中，作為下層培養(yǎng)基。將10 mL含有105個(gè)/mL鐮刀菌的PDA培養(yǎng)基均勻覆蓋在冷卻后的下層PDA培養(yǎng)基上，靜置冷卻1 h。而后在每塊平板上放置4個(gè)牛津杯，分別加入100 μL用PD液體培養(yǎng)基稀釋的Ag-SiO2納米粒(32 μg/mL)和 PD 液體培養(yǎng)基，水平放置直到液體完全滲透到培養(yǎng)基中。將處理后的平板置于(28±1)℃培養(yǎng)箱中，每個(gè)處理3次重復(fù)。培養(yǎng)3 d后，在體視顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)，研究Ag-SiO2納米粒對(duì)鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

采用凹玻片水滴法觀察Ag-SiO2納米粒對(duì)鐮刀菌孢子生長(zhǎng)的影響，吸取100 μL孢子懸浮液以及100 μL納米銀溶液混勻后，滴在載玻片上，加蓋蓋玻片，置于帶濕海綿的培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿放入(28±1)℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，分別于48、96 h后在倒置顯微鏡下鏡檢孢子的生長(zhǎng)發(fā)育情況。

1.7 菌體蛋白含量及抗氧化相關(guān)酶活性的測(cè)定

在PDA平板中接種鐮刀菌，培養(yǎng)3 d后，用打孔器打取直徑4 mm的菌碟，轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)5 d后，取出長(zhǎng)好的鐮刀菌菌絲體，用蒸餾水沖洗3次后用吸水紙吸干，準(zhǔn)確稱取質(zhì)量0.25 g菌絲，分別放入100 mL納米銀(32 μg/mL)溶液和蒸餾水對(duì)照溶液中浸泡2、4、10和20 h，菌絲體過濾取出后用蒸餾水沖洗3次后用吸水紙吸干，加入0.86%生理鹽水3 mL在冰浴下研磨，3000 r/min離心15 min，取上清液，置于4℃冰箱保存，待用。待測(cè)液蛋白質(zhì)含量通過 Bradford法［13］測(cè)定。蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線利用不同濃度牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制。超氧化物歧化酶活力采用NBT法測(cè)定［14］。過氧化氫酶酶活力測(cè)定參照文獻(xiàn)［15］的方法，過氧化物酶活力測(cè)定參照文獻(xiàn)［16］的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ag-SiO2納米粒的制備及表征分析

對(duì)Ag-SiO2納米粒形成過程進(jìn)行了紫外光譜分析，如圖1(a)所示。由圖1(a)可知，隨著抗壞血酸的加入，410 nm附近逐漸出現(xiàn)吸收峰，為單質(zhì)Ag+的特征吸收峰［17］。說明隨著反應(yīng)的進(jìn)行有Ag+被還原出來。而隨后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在410 nm附近Ag+特征吸收峰存在一定的紅移，從408 nm處到414 nm，提示Ag+納米粒逐漸被SiO2外殼所包覆，這與參考文獻(xiàn)［11］報(bào)道一致。而環(huán)境掃描電鏡顯示(圖1(b))納米粒為近似球形，粒徑約為100 nm。為進(jìn)一步確定Ag-SiO2納米粒的平均粒徑，試樣經(jīng)乙醇分散，去離子水稀釋后通過激光粒度儀測(cè)定(圖1(c))，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所制備納米粒平均粒徑為92.9 nm。

圖1 Ag-SiO2納米粒的表征Fig.1 Characterization of Ag-SiO2nanoparticles

2.2 對(duì)鐮刀菌的生長(zhǎng)抑制作用

圖2為Ag-SiO2納米溶液對(duì)鐮刀菌的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖2可知，在抑菌圈試驗(yàn)中，Ag-SiO2納米溶液對(duì)鐮刀菌表現(xiàn)出良好的抑制作用，最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)為4 μg/mL，且抑制效果隨濃度增大而增強(qiáng)，在32 μg/mL條件下，其抑制效果最好。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以此濃度進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

圖3為Ag-SiO2納米粒對(duì)香石竹鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)形態(tài)的影響結(jié)果。由圖3可知:在32 μg/mL Ag-SiO2納米粒作用下，鐮刀菌菌絲體的生長(zhǎng)呈現(xiàn)異常狀態(tài)，菌絲較細(xì)、分支減少、欲折、透明度差，而對(duì)照菌絲生長(zhǎng)正常、粗細(xì)均勻、分支較多、透明度較大。由此可知，Ag-SiO2納米?？赡軙?huì)促使鐮刀菌畸變，使其無法正常生長(zhǎng)，失去侵染植物能力。

圖2 Ag-SiO2納米粒對(duì)香石竹鐮刀菌的生長(zhǎng)抑制影響Fig.2 Effects of the Ag-SiO2nanoparticles on growth inhibition of Fusarium oxysporum f.sp.dianthi

圖3 Ag-SiO2納米粒對(duì)香石竹鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)形態(tài)的影響Fig.3 Effects of Ag-SiO2nanoparticles on mycelia growth of Fusarium oxysporum f.sp.Dianthi

以不同濃度Ag-SiO2納米粒處理鐮刀菌孢子，在24、72 h對(duì)孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:在對(duì)照條件下，一個(gè)產(chǎn)孢細(xì)胞上可相繼形成多個(gè)產(chǎn)孢位點(diǎn)，每個(gè)產(chǎn)孢位點(diǎn)以吹泡式產(chǎn)生全壁芽殖式分生孢子。且隨著納米銀濃度的加大，產(chǎn)孢位點(diǎn)逐漸減少，并不能正常分生出小孢子。后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察到，在高濃度納米銀處理組(128 μg/mL)作用下，菌絲已經(jīng)無法分生出孢子。

圖4 Ag-SiO2納米粒濃度對(duì)香石竹鐮刀菌孢子形態(tài)的影響Fig.4 Effects of Ag-SiO2nanoparticles concertration on spore morphology of Fusarium oxysporum f.sp.Dianthi

2.3 Ag-SiO2納米粒對(duì)鐮刀菌體蛋白含量的影響

考察Ag-SiO2納米粒對(duì)鐮刀菌體蛋白含量的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知:經(jīng)32 μg/mL Ag-SiO2納米粒處理后，發(fā)現(xiàn)鐮刀菌菌體的可溶性蛋白含量變化范圍較小，處理4 h后，菌體中可溶性蛋白含量比對(duì)照升高了8.50%，而處理20 h則比對(duì)照降低了1.47%。這與孫冬梅等［18］報(bào)道的納米銀對(duì)大豆菌核病核盤菌的抑制中可溶性蛋白變化相一致，而一些研究者也發(fā)現(xiàn)某些抑菌劑能抑制菌體蛋白質(zhì)的合成［19］，推測(cè)Ag-SiO2納米粒對(duì)菌體的抑制并非通過抑制蛋白質(zhì)的合成而起作用。

圖5 Ag-SiO2納米粒對(duì)鐮刀菌體蛋白的影響Fig.5 Effects of Ag-SiO2nanoparticles on mycelium protein content of Fusarium oxysporum f.sp.dianthi

2.4 Ag-SiO2納米粒對(duì)鐮刀菌抗氧化酶活性的影響

圖6為Ag-SiO2納米粒對(duì)鐮刀菌抗氧化酶活性的影響結(jié)果。由圖6可知:經(jīng)Ag-SiO2納米粒處理后，鐮刀菌菌體的總超氧化物歧化酶(SOD)活性增加，處理4 h后比對(duì)照組活性升高了28.14%，說明過氧化氫酶(CAT)在活性氧代謝中發(fā)揮重要的作用，是清除H2O2的主要酶類。菌絲處理2、4 h后，菌體過氧化氫酶活性分別比對(duì)照升高了48.18%、37.09%，而處理10、20 h比對(duì)照降低了15.00%、46.93%。Ag-SiO2納米粒處理后鐮刀菌菌體過氧化物酶(POD)活性變化較大，處理2、4、10 h分別比對(duì)照升高170.42%、98.68%、36.69%。處理20 h比對(duì)照降低了47.16%。

3 結(jié)論

本文以AgNO3作為Ag+來源，利用抗壞血酸對(duì)其進(jìn)行還原生成銀納米粒核心;利用正硅酸四乙酯的水解與聚合反應(yīng)獲得SiO2，使其包裹在銀核心外形成介孔外殼，最終制備Ag-SiO2核殼型納米粒，平均粒徑約為92.9 nm，發(fā)現(xiàn)可以有效地抑制香石竹鐮刀菌的生長(zhǎng)，且最小抑菌質(zhì)量濃度為4 μg/mL。

圖6 Ag-SiO2納米粒對(duì)鐮刀菌總SOD、CAT和POD活性的影響Fig.6 Effects of Ag-SiO2nanoparticles on SOD(a)，CAT(b)and POD(c)activity of Fusarium oxysporum f.sp.dianthi mycelium

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Ag-SiO2核殼型納米?？赡芡ㄟ^真菌中活性氧的誘導(dǎo)產(chǎn)生，導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)畸形、孢子分生困難，從而抑制真菌的生長(zhǎng)。隨著納米銀材料在醫(yī)藥領(lǐng)域上的廣泛應(yīng)用，納米銀的制備，抗菌和抗腫瘤機(jī)制被越來越深入地探討，但在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用還少見報(bào)道，本研究為其在植物病原真菌防治上的應(yīng)用提供了Ag-SiO2核殼型納米粒合成的方法，該方法簡(jiǎn)單有效且低成本。由此可見深入了解納米銀的抗菌機(jī)制，對(duì)于實(shí)現(xiàn)及農(nóng)業(yè)應(yīng)用也非常重要。

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