合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染患者的中樞HIV-1載量和變異性增高

劉遠志 陳兵剛 丁 渭 喬錄新 趙青霞 吳 昊 陳德喜 張玉林*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染中心，北京100069;2.山東省濱州市中心醫(yī)院感染內(nèi)科，山東濱州251700;3.北京市肝病研究所，北京100069;4.河南省傳染病醫(yī)院感染科，鄭州450015)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)機會性感染(opportunistic infections，OIs)是人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者最嚴重合并癥之一［1］。雖然高活性抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)顯著改善HIV感染者生存期和生活質(zhì)量，但是CNS OIs仍然是這類患者預(yù)后不良的重要因素［2-3］。

筆者之前報道［4-5］了我國河南獻血人群中樞神經(jīng)系統(tǒng)HIV-1亞型主要是B或B'，針對gp120 C2-V5區(qū)序列分析提示外周血病毒準種變異性明顯高于CNS，HIV-1合并神經(jīng)認知障礙者中樞HIV-1病毒準種變異性也明顯增高［6-7］。本研究中，筆者將對合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染患者中樞HIV-1 gp120 C2-V5區(qū)序列進行分析，研究HIV-1病毒學特征，并探索其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染的關(guān)系。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

研究對象為40例輸血感染HIV-1且處于艾滋病期人群。其中，24名來自河南省傳染病醫(yī)院的艾滋病患者確診合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染。排除標準包括年齡小于18歲，有先天性或慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病、慢性代謝疾病、腦血管疾病及腦瘤病史等。此外，16個未患中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染來自相同人群的HIV-1感染者作為對照組。該項研究經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會審核批準，所有患者均簽署書面知情同意。

1.2 臨床評估和HIV-1病毒載量檢測

HIV-1感染通過酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫印跡法確診。依據(jù)《美國成人和青少年HIV合并機會性感染防治指南》［8］，根據(jù)患者臨床癥狀、體征、影像學和病原學檢查進行診斷。弓形蟲腦炎根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征;頭部CT掃描顯示顱內(nèi)多發(fā)環(huán)形病灶;血清抗弓形蟲IgG抗體進行性升高;結(jié)合弓形蟲肺部感染、心包炎和彌漫性弓形蟲病等進行診斷。隱球菌腦膜炎可出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、頸項強直、視力障礙和意識障礙等癥狀，腦脊液壓力顯著增高;腦脊液墨汁染色和血清乳膠凝集試驗陽性進行診斷。巨細胞病毒腦炎可根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀隱匿或不典型，但較少出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛癥狀;頭部CT和MRI檢查可見雙側(cè)大腦半球炎、腦室炎、腦膜炎和腦梗死、腦萎縮、腦積水等;增強掃描顯示室管膜強化，表現(xiàn)為環(huán)形病灶;主要結(jié)合血清巨細胞病毒抗原陽性及腦脊液PCR檢測綜合評估診斷。進行性多灶性腦白質(zhì)病可出現(xiàn)偏癱或輕癱導致的肢體無力、步態(tài)不穩(wěn)、認知功能障礙和構(gòu)音障礙癥狀;CT表現(xiàn)為腦白質(zhì)多灶性低密度影;MRI檢查T2WI序列呈高信號，增強后病灶無強化或僅病灶周圍出現(xiàn)輕度強化;腦脊液JC病毒PCR檢測協(xié)助診斷。臨床和實驗室數(shù)據(jù)包括性別、年齡、HIV-1感染時間、HAART時間、血白細胞計數(shù)、腦脊液細胞計數(shù)、腦脊液生化指標等。CD4+T細胞計數(shù)通過流式細胞術(shù)進行(BD FACS CantoMⅡ)。血漿和腦脊液的HIV-RNA水平通過RT-PCR測量(羅氏Amplicor，v.1.5，檢測下限50 Copys/mL)。

1.3 腦脊液HIV-1 RNA gp120 C2-V5區(qū)擴增

CSF HIV-1 RNA純化提取使用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒(Qiagen，Duesseldorf，德國)，依照廠商提供的說明書操作;提取的RNA迅速通過SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，California，USA)反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)為cDNA，具體步驟按照生產(chǎn)廠家提供的說明書操作。注意操作過程中標本的交叉污染。上述cDNA通過PCR反應(yīng)擴增其中的C2-V5區(qū)核苷酸序列，應(yīng)用成對設(shè)計引物的巢式PCR，引物序列:外側(cè)正向引物:5'－atgggatcaaagcctaaagccatgtg－3'，外側(cè)反向引物:5'－gcgcccatagtgcttcctgctgctgc－3'，內(nèi)側(cè)正向引物:5'－ctgttaaatggcagtctagc－3'，內(nèi)側(cè)反向引物:5'－acttctccaattgtccctcat－3'。采用常規(guī)反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。設(shè)立多組陰性對照，檢測實驗過程中可能出現(xiàn)的模板污染。PCR產(chǎn)物通過TA載體進行分子克隆(Takara大連，中國)。每一標本隨機選擇6～8個克隆，然后用ABI3730遺傳分析系統(tǒng)測序。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料和臨床特征

24例中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染者和16個感染HIV-1的對照組患者都是在1994和1995年期間通過獻血染病，他們在2008年1月至2012年12月間作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染者或是非中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染者(對照組)參加研究，當時他們的CD4計數(shù)都低于200個 /mm3。24名中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染者包含11名弓形蟲腦炎、5名隱球菌腦膜炎、6名巨細胞病毒腦炎和2名進行性多灶性腦白質(zhì)病。依據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心分類標準，24例實驗組患者均進入C3期，16例對照組患者屬于B3期。所有患者都進行免費聯(lián)合抗病毒治療，治療方案包括2個核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(拉米夫定和齊多夫定)聯(lián)合一個非核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(奈韋拉平)。24名中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染者同時接受抗感染治療及對癥治療?；颊吣挲g、性別、HIV-感染時間、聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(combined antiretroviral therapy，cART)時間、白細胞計數(shù)和腦脊液生化指標:白細胞計數(shù)、蛋白質(zhì)、葡萄糖和氯化物詳見表1。其中實驗組患者男性15例，女性9例，平均年齡為(46.56±21.45)歲。實驗組與對照組之間年齡、性別比例、HIV-1感染時間和白細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，但實驗組接受聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療時間較短。此外，實驗組腦脊液白細胞計數(shù)和蛋白質(zhì)濃度較高，葡萄糖濃度較低。

表1 一般資料和臨床特征Tab.1 The participants'demographic and clinical characteristics (±s)

表1 一般資料和臨床特征Tab.1 The participants'demographic and clinical characteristics (±s)

HIV-1:human immunodeficiency virus type 1;cART:combined antiretroviral therapy;CSF:cerebro-spinal fluid;CNS:central nervous system;OIS:opportunistic infection;NS:not significant.

Item Control(n=16) CNS OIs(n=24)P Age/a 49.63±25.31 46.56±21.45 NS Male/n(%) 7(43.75) 15(62.5) NS HIV-1 infection time/a 16.44±2.38 17.34±1.81 NS cART time/months 16.38±6.45 3.26±1.73 P＜0.05 White blood cells/(×109·L－1) 6.45±3.16 5.87±2.56 NS White blood cells count in CSF/(×106·L－1) 3.47±2.64 23.54±13.68 P＜0.05 Protein in CSF/(g·L－1) 0.58±0.24 3.69±2.98 P＜0.05 Glucose in CSF/(mmol·L－1) 3.849±2.47 1.53±1.23 P ＜0.05 Chloride in CSF/(mmol·L－1) 128.470±70.54 103.22±81.46 NS

2.2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染患者的腦脊液病毒載量明顯增高

實驗組血漿平均HIV載量(HIV RNA log10 copies/mL)為3.60±1.26，CSF為 6.09± 2.43;而對照組血漿平均HIV載量2.59±1.45，CSF為0.26 ±0.21。兩組間血漿HIV載量無差別，但實驗組CSF HIV載量明顯高于對照組(圖1A)。實驗組和對照組CD4細胞計數(shù)，差異無統(tǒng)計學意義(圖1B)。對照組腦脊液與血漿HIV載量(圖1C)，以及實驗組腦脊液和血漿中HIV載量都沒有線性相關(guān)性(圖1D)。同樣，對照組CSF HIV載量與CD4計數(shù)(圖1E)，以及實驗組CSF HIV載量與CD4計數(shù)之間無線性相關(guān)性(圖1F)。同時，實驗組CSF HIV載量和CSF炎性反應(yīng)指標:白細胞計數(shù)、蛋白質(zhì)、葡萄糖和氯化物之間也沒有相關(guān)性。

2.3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染患者腦脊液HIV-1準種變異性增加

本研究從24例實驗組和16例對照組患者腦脊液中分離了病毒RNA，然后擴增C2-V5(env)區(qū)。在TA克隆法和測序后，實驗組總共獲得114個陽性克隆，包括弓形蟲腦炎58個，隱球菌性腦膜炎25個，巨細胞病毒腦炎23個和進行性多灶性腦白質(zhì)病8個;對照組獲得76個陽性克隆。通過Mega 5.0軟件包將獲得的序列與從GenBank獲取的參考序列15_01B.TH99.99TH_MU2079_ACC_AF516184進行比對，建立相鄰進化樹(圖2A)。通過測定各序列與標準序列之間的核苷酸距離，并進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)實驗組病毒變異性明顯高于對照組(P＜0.000 1)(圖2B)。

圖1 血漿、腦脊液病毒載量及CD4細胞計數(shù)之間關(guān)系Fig.1 The correlation of plasma viral load and cerebrospinal fluid viral load and CD4 count

圖2 HIV C2-V5區(qū)序列進化樹及兩組序列與參照株之間核苷酸距離比較Fig.2 Diversity of CSF HIV-1 quasispecies in patients with CNS OIs

3 討論

HIV通過感染CD4細胞侵犯機體免疫系統(tǒng)，最終可產(chǎn)生全身多系統(tǒng)機會性感染，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機會性感染較為常見［9］，病原學種類多，病情危重，病死率高［10］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染通常發(fā)生在腦脊液。CD4細胞計數(shù)小于200個 /mm3［2］者 HIV-1 RNA的檢測率在那些腦脊液CD4計數(shù)低于200個/mm3，以及血漿中能檢測出HIV-1 RNA的患者中較高［11］。此前也有報道［12］患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者腦脊液病毒載量較高，但是血漿病毒載量并不高。此外，腦脊液病毒檢出率也與是否接受抗病毒治療有關(guān)。本研究中，筆者還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染患者腦脊液病毒載量較高，但與血漿病毒載量和CD4細胞計數(shù)無明顯相關(guān)性?？共《局委煂δX脊液病毒載量影響似乎大于血漿(當然這需要大樣本的研究進一步證實)。此前有報道［13］腦脊液HIV-1 RNA的水平和腦脊液的單核細胞計數(shù)之間有緊密關(guān)系，但本研究并未發(fā)現(xiàn)這一點。

HIV病毒準種變異性與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)性尚不確定［14］。筆者既往報道［4-5］HIV 感染者血漿病毒C2-V5區(qū)變異性明顯高于腦脊液。HIV合并神經(jīng)認知障礙患者中樞病毒變異性明顯增高［7］。HIV相關(guān)中樞神經(jīng)損傷與外周感染的HIV透過血-腦脊液屏障進入并定植于 CNS，產(chǎn)生炎性反應(yīng)密切有關(guān)［15］。由于表面缺乏HIV感染所必需的CD4受體，神經(jīng)元本身一般不感染HIV。由此，感染HIV的炎性反應(yīng)細胞(包括CD4+淋巴細胞，單核/巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞)在HIV病毒與神經(jīng)元之間建立起了損傷的紐帶。上述感染了HIV-1的炎性反應(yīng)細胞可釋放病毒顆粒和炎性反應(yīng)介質(zhì)，進而通過神經(jīng)元表面的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)和趨化因子受體等激活細胞表面和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子通道，導致細胞內(nèi)鈣超載和超氧離子增多，誘導神經(jīng)元凋亡［16-20］。筆者既往研究［4-5］發(fā)現(xiàn)中樞HIV-1病毒CCR5嗜性，變異性小于外周。gp120 V3環(huán)多肽可誘導原代培養(yǎng)的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細胞凋亡，并抑制神經(jīng)突起的形成［21］。艾滋病患者腦脊液超氧離子增加，尸檢大腦皮質(zhì)組織標本氧化損傷明顯［7］。由此可見，HIV病毒啟動中樞神經(jīng)炎性損傷，并扮演重要角色。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染患者的腦脊液病毒膜區(qū)變異性明顯增高，這也許與中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染的形成及病情進展相關(guān)。由此可見，病毒啟動——炎性反應(yīng)介導——神經(jīng)損傷正是HIV神經(jīng)病變(包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染性病變)發(fā)病機制的主要路徑。其中每一個環(huán)節(jié)的確切機制仍需深入研究，這也正是我們目前和將來的研究方向。

［1］Opportunistic Infections Project Team of the Collaboration of Bbservational HIV Epidemiological Research in Europe C01.CD4 cell count and the risk of AIDS or death in HIVInfected adults on combination antiretroviral therapy with a suppressed viral load:a longitudinal cohort study from COHERE［J］.PLoS Med，2012，9(3):e1001194.

［2］Tan I L，Smith B R，Von Geldern G，et al.HIV-associated opportunistic infections of the CNS［J］.Lancet Neurol，2012，11(7):605-617.

［3］Riveiro-Barciela M，F(xiàn)alcó V，Burgos J，et al.Neurological opportunistic infections and neurological immune reconstitution syndrome:impact of one decade of highly active antiretroviral treatment in a tertiary hospital［J］.HIV Med，2013，14(1):21-30.

［4］Wei F，Wang X，Liu L，et al.Characterization of HIV type 1 env gene in cerebrospinal fluid and blood of infected Chinese patients［j］.AIDS Res Hum Retroviruses，2011，27(7):793-796.

［5］Liu L，ZhAO Q，Wei F，et al.Genetic analysis of HIV type 1 env gene in cerebrospinal fluid and plasma of infected Chinese paid blood donors［J］.AIDS Res Hum Retroviruses，2012，28(1):106-109.

［6］Zhang Y，Qiao L，Ding W，et al.An initial screening for HIV-associated neurocognitive disorders of HIV-1 infected patients in China［J］.J Neurovirol，2012，18(2):120-126.

［7］Zhang Y，Wang M，Li H，et al.Accumulation of nuclear and mitochondrial DNA damage in the frontal cortex cells of patients with HIV-associated neurocognitive disorders［J］.Brain Res，2012，1458:1-11.

［8］Masur H，Kaplan J E.New guidelines for the management of HIV-related opportunistic infections［J］.JAMA，2009，301(22):2378-2380.

［9］宋鳳麗，張玉林，喬錄新，等.中國HIV-1感染人群神經(jīng)認知損害初步篩查［J］.首都醫(yī)科大學學報，2012，33(5):610-615.

［10］Mocroft A J，Lundgren J D，d'Armino Monforte A，et al.Survival of AIDS patients according to type of AIDS-defining event.The AIDS in Europe Study Group［J］.Int J Epidemiol，1997，26(2):400-407.

［11］Christo P P，Greco D B，Aleixo A W，et al.Factors influencing cerebrospinal fluid and plasma HIV-1 RNA detection rate in patients with and without opportunistic neurological disease during the HAART era［J］.BMC Infect Dis，2007，7:147.

［12］Christo P P，Greco D B，Aleixo A W，et al.HIV-1 RNA levels in cerebrospinal fluid and plasma and their correlation with opportunistic neurological diseases in a Brazilian AIDS reference hospital［J］.Arq Neuropsiquiatr，2005，63(4):907-913.

［13］Martin C，Albert J，Hansson P，et al.Cerebrospinal fluid mononuclear cell counts influence CSF HIV-1 RNA levels［J］.J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol，1998，17(3):214-219.

［14］van Marle G，Power C.Human immunodeficiency virus type 1 genetic diversity in the nervous system:evolutionary epiphenomenon or disease determinant［J］.J Neurovirol，2005，11(2):107-128.

［15］Persidsky Y，Gendelman H E.Mononuclear phagocyte immunity and the neuropathogenesis of HIV-1 infection［J］.J Leukoc Biol，2003，74(5):691-701.

［16］Wu D T，Woodman S E，Weiss J M，et al.Mechanisms of leukocyte trafficking into the CNS［J］.J Neurovirol，2000，6(Suppl 1):82-85.

［17］Gras G，Kaul M.Molecular mechanisms of neuroinvasion by monocytes-macrophages in HIV-1 infection［J］.Retrovirology，2010，7:30.

［18］Wang H，Sun J，Goldstein H.Human immunodeficiency virus type 1 infection increases the in vivo capacity of peripheral monocytes to cross the blood-brain barrier into the brain and the in vivo sensitivity of the blood-brain barrier to disruption by lipopolysaccharide［J］.J Virol，2008，82(15):7591-7600.

［19］Haughey N J，Mattson M P.Calcium dysregulation and neuronal apoptosis by the HIV-1 proteins Tat and gp120［J］.J Acquir Immune Defic Syndr，2002，31(Suppl 2):55-61.

［20］Wang Z，Pekarskaya O，Bencheikh M，et al.Reduced expression of glutamate transporter EAAT2 and impaired glutamate transport in human primary astrocytes exposed to HIV-1 or gp120［J］.Virology，2003，312(1):60-73.

［21］Zhang Y，Shi Y，Qiao L，et al.Sigma-1 receptor agonists provide neuroprotection against gp120 via a change in bcl-2 expression in mouse neuronal cultures［J］.Brain Res，2012，1431:13-22.