熒光分析法測定元寶楓葉中總黃酮含量的研究

馬登磊 邵建群 何深知 張 楓*

(1.首都醫(yī)科大學化學生物學與藥學院實驗教學中心，北京100069;2.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥物研究室，北京100053)

元寶楓(Acer truncatum Bunge)又叫五角楓，屬槭樹科槭樹屬落葉喬木，是中國特有的樹種。元寶楓葉中含有黃酮、多酚、綠原酸等多種化學成分［1-3］，而黃酮類物質(zhì)是其重要的活性成分之一。近年來的研究［4-5］顯示，不僅元寶楓葉提取物中黃酮類物質(zhì)具有較強的自由基清除能力和抗氧化性，而且還對治療肥胖的潛在靶點脂肪酸合酶有較強的抑制作用［6－7］，因而研究元寶楓葉黃酮類物質(zhì)的測定方法是非常必要的。

目前分析測定黃酮的方法有紫外分光光度法和高效液相色譜法［8-10］。高效液相色譜法雖然精度高，但適用于黃酮單體的定量分析，而總黃酮含量的測定主要采用紫外分光光度法?，F(xiàn)有的研究［11-12］顯示，用硝酸鋁紫外分光光度法測定總黃酮時，綠原酸的存在可能對結(jié)果有干擾，因鄰二酚類結(jié)構(gòu)與Al3+形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，并使測定的總黃酮含量偏高。由于元寶楓葉提取物中除含有黃酮，還含有綠原酸等其他物質(zhì)，所以必須設(shè)法降低綠原酸對測定結(jié)果的干擾。根據(jù)黃酮類化合物能與鋁離子形成穩(wěn)定的熒光絡合物的特性，本文采用了熒光分析法并對測定元寶楓葉中的總黃酮含量進行了多方面的實驗，希望本研究所建立的方法能為元寶楓葉中總黃酮含量測定提供參考。

1 實驗方法

1.1 儀器

F-2500型熒光分光光度計(日本島津公司);TGL-16型高速臺式離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠);KQ-50B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);石英比色皿(宜興市晶科光學儀器有限公司);BT25S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 材料

蘆丁標準對照品(中國藥品生物制品檢定所，0080－9705);綠原酸標準對照品(中國藥品生物制品鑒定所，110753－200212)。分析純試劑有三水合乙酸鈉(西隴化工股份有限公司);硝酸鋁(北京現(xiàn)代東方精細化學品有限公司);無水乙酸(北京化工廠)，無水乙醇(北京化工廠)。水為蒸餾水，元寶楓落葉采自陜西楊陵(粉碎機磨碎并過40目篩)。

1.3 蘆丁標準溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品10 mg于50 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解定容，準確吸取此溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加入5%的Al(NO3)3溶液1 mL，pH=5的醋酸-醋酸鈉緩沖液3 mL。用60%乙醇定容，搖勻，即配成標準工作溶液。

1.4 樣品溶液的制備

稱取元寶楓葉細粉1g于錐形瓶中，加入60%乙醇30 mL，室溫條件下超聲提取30 min，然后12 000 r/min離心6 min。取上清液置于另一個錐形瓶中，室溫避光保存，此為元寶楓葉提取液的樣品溶液。

測定時，吸取100 μL樣品溶液，置于10 mL容量瓶中，加入5%的Al(NO3)3溶液1 mL，pH=5的醋酸－醋酸鈉緩沖液3 mL。用60%乙醇定容，搖勻，即配成樣品工作溶液。

1.5 總黃酮含量測定

在激發(fā)光譜通帶寬度5 nm，發(fā)射光譜通帶寬度5 nm，激發(fā)波長λ=470 nm，發(fā)射波長λ=547 nm的條件下，測定蘆丁標準工作溶液的熒光強度，以熒光強度對相應的濃度作圖，繪制標準曲線，然后在相同的條件下測定樣品溶液的熒光強度，再根據(jù)回歸方程求出含量。同時，按選定的實驗方法即60%乙醇為溶劑，加入1 mL 5%Al(NO3)3，調(diào)樣品溶液 pH=5，對樣品溶液進行了相關(guān)的方法學考察研究。

2 結(jié)果

2.1 熒光化合物的激發(fā)和發(fā)射光譜

按照實驗方法選擇光譜通帶寬度5 nm，對蘆丁溶液的激發(fā)和發(fā)射光譜進行掃描?？紤]到綠原酸對熒光的影響，本實驗本著盡量避開綠原酸的影響并且保證獲得較好的發(fā)射光譜的原則，選擇的激發(fā)和發(fā)射波長為470 nm和547 nm。

2.2 測定條件的選擇

2.2.1 溶劑濃度的影響

黃酮類化合物難溶于水，易溶于有機溶劑。本實驗選擇常用于植物中黃酮提取的乙醇作為溶劑，并考察不同體積分數(shù)的乙醇對熒光強度的影響。圖1為加入5%硝酸鋁溶液1 mL，pH=5的測定結(jié)果，此圖表明乙醇的體積分數(shù)越大，蘆丁的熒光強度越大?？紤]到乙醇體積分數(shù)越大，揮發(fā)性越大，實驗操作中對測定產(chǎn)生影響也會變大，本實驗選擇了60%乙醇溶液作為溶劑。

圖1 乙醇體積分數(shù)對熒光強度的影響Fig.1 Effects of different ethanol concentration on the fluorescence intensity

2.2.2 Al(NO3)3加入量的影響

黃酮類化合物與鋁離子可生成穩(wěn)定的熒光配合物，Al(NO3)3的用量可對熒光強度造成影響。在10 mL的容量瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的蘆丁標準溶液，分別加入 5%Al(NO3)3溶液為 0、0.5、1、1.5、2、3 mL，以60%的乙醇為溶劑，pH=5時測定各溶液的熒光強度值，圖2的結(jié)果表明，當5%Al(NO3)3溶液用量為0.5 mL和1 mL時熒光強度較大。本實驗選擇采用加入5%Al(NO3)3為1 mL。

圖2 5%硝酸鋁溶液用量對熒光強度的影響Fig.2 Effects of dosage of 5%Al(NO3)3 solution on the fluorescence intensity

2.2.3 溶液pH值的影響

不同酸度的溶液會對黃酮類化合物與鋁離子生成配合物的穩(wěn)定性，以及熒光強度產(chǎn)生影響。以60%的乙醇為溶劑，加入5%硝酸鋁溶液1 mL，采用醋酸－ 醋酸鈉為緩沖液，配制 pH 值分別為2、3、4、4.5、5、6的蘆丁測定溶液，并進行熒光強度測定。根據(jù)圖3結(jié)果，隨著pH值的增加，熒光強度也在增大。由于pH=6時測定溶液中有沉淀出現(xiàn)，故實驗選擇pH=5作為測定溶液的酸度，即在10 mL中加入pH=5的醋酸－醋酸鈉緩沖液3 mL。

圖3 溶液pH值對熒光強度的影響Fig.3 Effects of the solution acidity on the fluorescence intensity

2.2.4 放置時間的影響

在上述實驗條件下，將蘆丁的測定溶液靜置于室內(nèi)，并避免陽光直射。在不同時間測定溶液的熒光強度。由圖4可知，在靜置120 min內(nèi)熒光強度變化不大，這說明在本實驗條件下所配制的溶液很穩(wěn)定?？紤]到實驗方法的一致性，選擇放置30 min后測定熒光強度。

圖4 靜置時間對熒光強度的影響Fig.4 Effects of standing time on fluorescence intensity

2.2.5 綠原酸的影響

元寶楓葉提取物中含有綠原酸，綠原酸為3－咖啡酰奎尼酸，分子結(jié)構(gòu)中含有鄰二酚羥基，也可與Al3+形成配合物而發(fā)出熒光，從而對黃酮含量的測定產(chǎn)生影響。為了考察綠原酸對黃酮測定的影響，選擇不同的激發(fā)波長，對樣品中加入不同質(zhì)量濃度的綠原酸進行對比分析研究。

表1中的第1組數(shù)據(jù)是未加綠原酸的樣品溶液熒光強度值，ΔF值分別是第2、3組加綠原酸與第1組未加綠原酸熒光強度數(shù)值的差值。從表1可以看出，在元寶楓葉提取物的樣品溶液中加入綠原酸之后，其熒光強度會變大。為了盡可能減少綠原酸的影響，并確保測定結(jié)果的準確性，實驗選擇了ΔF值變化相對較小的470 nm為激發(fā)波長。

由于綠原酸的存在，是可能導致對元寶楓葉提取物中總黃酮含量測定結(jié)果偏高的原因，圖5和圖6分別為綠原酸與Al3+結(jié)合后，在λem=547 nm掃描的激發(fā)光譜和在λex=470 nm掃描的熒光光譜(發(fā)射光譜)。從圖5的激發(fā)光譜圖可以看到，激發(fā)波長需要大于450 nm，才可以降低綠原酸在547 nm處的熒光強度。圖6的熒光光譜圖可知，在波長大于490 nm的范圍內(nèi)，綠原酸與Al3+結(jié)合所產(chǎn)生的熒光強度已很低。

2.3 標準曲線及方法檢出限

實驗表明，蘆丁質(zhì)量濃度在6.55×10－6mol/L～3.20×10－5mol/L的范圍內(nèi)與熒光強度具有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為:y=1.147 7x+0.430 4，

表1 綠原酸對熒光強度的影響Tab.1 Effects of chlorogenic acid on fluorescence intensity

式中:y表示熒光強度，x表示蘆丁的質(zhì)量濃度(μg/mL)，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 1。對空白對照液進行11次平行測定，根據(jù)公式CL=3S/K計算，方法檢出限為1.36×10－7mol/L。

圖5 綠原酸在λem=547 nm處的激發(fā)光譜Fig.5 Excitation spectrum of chlorogenic acid at λem=547 nm

圖6 綠原酸在λex=470 nm的熒光(發(fā)射)光譜Fig.6 Fluorescence(emission)spectrum of chlorogenic acid at λex=470 nm

2.4 樣品測定及回收率實驗

按選定的實驗方法，測定了元寶楓葉提取物中總黃酮的含量，并對樣品溶液進行了平行測定(n=5)，結(jié)果見表2。為了驗證實驗的準確性，在樣品溶液中加入蘆丁對照品進行回收率實驗，實驗結(jié)果見表3。

表2 元寶楓葉中總黃酮含量Tab.2 Contents of total flavonoid in the leaves of Acer truncatum Bunge (n=5)

表3 樣品回收率實驗結(jié)果Tab.3 Results of the recovery test of samples (n=5)

3 結(jié)論

本文采用熒光分析方法，測定元寶楓葉中總黃酮的含量。分別考察了乙醇體積分數(shù)、5%Al(NO3)3的加入量、pH大小、放置時間以及綠原酸對熒光強度的影響。由于綠原酸的存在，是可能導致對元寶楓葉提取物中總黃酮含量測定結(jié)果偏高的原因。故本實驗通過改變激發(fā)波長，從而減小綠原酸產(chǎn)生的熒光，進而減弱其對測定的影響。實驗表明蘆丁質(zhì)量濃度在6.55×10－6mol/L～3.20×10－5mol/L與熒光強度具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為 y=1.147 7x+0.430 4，R2=0.999 1，檢出限為1.36 ×10－7mol/L。

由于熒光分析法相對于紫外－可見分光光度法靈敏度高，而且本研究方法在穩(wěn)定性、準確度和精密度方面符合要求，實驗操作方法簡便易行。因此，可以作為測定元寶楓葉總黃酮含量的參考方法。

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