嚴(yán)重高三酰甘油血癥對小鼠生育及其后代糖脂代謝的影響

馬亞紅 阿布杜拉·熱西提 謝北辰 郭 鑫 楊金奎 劉國慶*

(1.北京市普仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100062;2.北京大學(xué)心血管研究所教育部分子心血管學(xué)重點實驗室，北京100191;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100730)

流行病學(xué)研究［1］表明，高三酰甘油血癥(hypertriglyceridemia，HTG)是動脈粥樣硬化的獨立危險因子之一，同時還會引起多器官的損害，例如胰腺炎［2］、腎功能損害［3］、神經(jīng)系統(tǒng)障礙［4］和糖代謝異常［5］等。

HTG常伴發(fā)于妊娠，因為在正常妊娠過程中，隨著雌激素濃度增加及胰島素抵抗的增強(qiáng)，糖脂代謝將發(fā)生明顯改變。自妊娠中期開始，脂肪貯量增加而利用減少，孕晚期脂肪組織較非妊娠期增加1.5～2.0倍，而血漿三酰甘油(triglycerides，TG)也可升高2～3倍，最高達(dá)200～300(1 mg/dL=0.011 3 mmol/L)，然后逐漸下降，在產(chǎn)后6周接近妊娠前濃度［6］。若妊娠前就有高脂血癥，則有可能發(fā)生嚴(yán)重HTG而誘發(fā)急性胰腺炎，其時孕產(chǎn)婦病死率為20%～50%，胎兒畸形、流產(chǎn)、早產(chǎn)、生長受限等不良妊娠結(jié)局明顯增高［7-8］。但關(guān)于HTG對后代出生后的遠(yuǎn)期影響如糖脂代謝的影響未見報道。

本研究應(yīng)用雌性載脂蛋白CIII(apolipoprotein CIII，Apo CIII)轉(zhuǎn)基因的嚴(yán)重HTG小鼠與正常雄性小鼠交配，并以正常雌性及雄性小鼠交配作為對照組，以觀察HTG小鼠是否能正常妊娠、分娩。成年Apo CIII轉(zhuǎn)基因的嚴(yán)重 HTG小鼠糖耐量正常［9］，本研究將進(jìn)一步探討雌性HTG小鼠對幼年后代TG以及與TG代謝密切相關(guān)的糖代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 小鼠的制備和繁殖

實驗用C57B6背景的Apo CIII轉(zhuǎn)基因小鼠來源于美國Jackson實驗室，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心SPF級動物房飼養(yǎng)。經(jīng)與ICR背景小鼠雜交5代，得到易于繁殖的ICRApo CIII轉(zhuǎn)基因小鼠用于本實驗，實驗動物許可證號:LA2010－059。

共6只轉(zhuǎn)基因雌性小鼠，與6只正常雄性小鼠交配;6只正常雌性小鼠，與6只正常雄性小鼠交配得到后代。于小鼠出生14 d離乳前1周測定禁食后2 h血漿 TG和總膽固醇 (total cholesterol，TC)濃度，依據(jù)血漿TG濃度將后代分為3組:母親為轉(zhuǎn)基因的正常后代(maternal control，MC)和轉(zhuǎn)基因后代(maternal transgenic，MT)及正常對照組(normal control，NC)。從3組后代中每組采用數(shù)字表法隨機(jī)抽取8只進(jìn)行血脂、血糖和胰島素檢測。

1.2 試驗方法

測量3組后代小鼠出生時體質(zhì)量并監(jiān)測小鼠生長情況，分別于出生3、6、9、12、14、28 d 測量3 組小鼠體質(zhì)量。

將上述3組動物飼養(yǎng)至28 d時即離乳后1周，禁食4 h后內(nèi)眥采血，放入離心管中，肝素抗凝，4℃下4 000 r/min離心10 min，分離出血漿，3組吸取血漿測定血漿 TG、TC、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)濃度。其中，MT組FBG和FINS在20 000 r/min超速離心30 min后取脂肪層下的去脂血漿進(jìn)行測定。

3組小鼠過夜禁食16 h(但不禁水)，50%的葡萄糖3g/kg灌胃，灌胃前及灌胃后30、60、90和120 min，內(nèi)眥采血放入離心管中，肝素抗凝，4℃下4 000 r/min離心10 min，分離出血漿測定血漿葡萄糖(blood glucose，BG)，其中MT組在20 000 r/min超速離心30 min后取脂肪層下的去脂血漿進(jìn)行測定。

1.3 血漿生化檢測

血漿TG和TC、BG濃度均用酶反應(yīng)比色法檢測，應(yīng)用BIO-RAD MODEL 550酶標(biāo)儀，檢測試劑盒購自北京中生北控科技股份有限公司，詳細(xì)操作方法參考試劑盒說明書。

1.4 胰島素檢測

應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法測定標(biāo)本中小鼠胰島素水平，應(yīng)用BIO-RAD MODEL 550酶標(biāo)儀，檢測試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司，詳細(xì)操作方法參考試劑盒說明書。

穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistant index，HOMA-IR)計算公式如下:HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，資料均呈正態(tài)分布，方差齊，均數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析方法及單因素重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析法檢驗，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Apo CIII轉(zhuǎn)基因?qū)е碌膰?yán)重HTG對雌性小鼠生育能力無影響

Apo CIII轉(zhuǎn)基因嚴(yán)重HTG的雌性小鼠可正常妊娠、分娩及哺乳。6只Apo CIII轉(zhuǎn)基因雌性小鼠與6只正常雄性小鼠交配共得到6窩71只后代，6只正常雌性小鼠，與6只正常雄性小鼠交配;共得到6窩70只后代。測定出生14 d小鼠的血漿TG，其中37只TG濃度＜300 mg/dL，為MC組，33只TG水平＞1500 mg/dL，為MT組。Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠生育后代(MC及MT)數(shù)量與正常雌雄小鼠交配生育的對照組后代(NC)數(shù)量相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。同樣，MC及MT組小鼠出生體質(zhì)量及生長速度均與NC組小鼠差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

圖1 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠生育后代數(shù)量與對照組的比較Fig.1 Comparison of litter size between female Apo CIII transgenic mice(♀Apo CIII+♂Apo CIII-)and normal controls(♀Apo CIII-♂Apo CIII-)

圖2 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠生育后代與對照組生育后代的生長曲線Fig.2 The growth curve of Apo CIII transgenic offspring of female mice and the control group offspring

2.2 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的轉(zhuǎn)基因后代血漿TG及TC濃度明顯增高

Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的轉(zhuǎn)基因后代血漿TG及TC水平于出生14及28 d均較非轉(zhuǎn)基因后代及正常對照組顯著升高(P＜0.01)，Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的非轉(zhuǎn)基因后代及正常對照組TG及TC濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表1。

表1 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的轉(zhuǎn)基因后代血脂水平與其他組的比較Tab.1 Comparisons of lipid testing between maternal transgenic and other groups(±s)

表1 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的轉(zhuǎn)基因后代血脂水平與其他組的比較Tab.1 Comparisons of lipid testing between maternal transgenic and other groups(±s)

*P＜0.01 vs MC and NC group;MT:maternal transgenic;MC:maternal control;NC:normal control;TG:triglycerides;TC:total cholesterol.

TG TC Group 14 days 28 days MT 4 276.9±1 766.0* 3 148.9±803.7* 572.4±127.6* 444.8±117.9 14 days 28 days*MC 212.8±131.5 84.6±20.5 235.8±81.2 118.8±21.5 NC 205.3±87.0 72.9±22.7 265.9±40.8 126.3±13.4

2.3 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的母轉(zhuǎn)基因后代離乳后幼鼠發(fā)生糖耐量異常和胰島素抵抗

3組動物的FBG差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但MT組小鼠灌胃后30 min BG顯著高于MC、NC組(P＜0.01)，3組動物灌胃后60、90和120 min BG比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。Apo CIII轉(zhuǎn)基因雌鼠的HTG后代表現(xiàn)為輕度糖耐量受損，而Apo CIII轉(zhuǎn)基因雌鼠所產(chǎn)的非HTG后代則糖耐量正常，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。MT組小鼠FINS濃度較其他2組明顯增高(P＜0.05)，HOMA-IR也較其他2組增高(P＜0.05)。這提示MT組幼鼠在出生后28 d已經(jīng)出現(xiàn)胰島素抵抗(圖4)。

圖3 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的轉(zhuǎn)基因后代口服葡萄糖耐量實驗與其他組的比較Fig.3 Comparison of oral glucose tolerance tests results among maternal transgenic and other groups

圖4 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的轉(zhuǎn)基因后代Fins及HOMA-IR與其他組的比較Fig.4 Comparison of fasting insulin and HOMA-IR among maternal transgenic and other groups

3 討論

HTG主要由富含三酰甘油脂蛋白(triglyceriderich lipoproteins，TRLs)的代謝障礙所引起，是代謝綜合征的主要表現(xiàn)之一。環(huán)境因素在HTG的發(fā)生中起重要作用，如高脂、高碳水化合物的飲食習(xí)慣，缺乏體力活動等。遺傳因素如水解TRLs中三酰甘油的脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)及調(diào)控LPL活性的載脂蛋白、轉(zhuǎn)運體、活化因子等基因的變異，可通過與環(huán)境因素的相互作用而影響HTG的發(fā)生，在脂代謝中發(fā)揮重要作用。Apo CⅢ作為對代謝TRLs起重要作用的 LPL的抑制物［10］，與 HTG 的發(fā)生密切相關(guān)［11］。最近有關(guān)Apo CⅢ的重要發(fā)現(xiàn)［12］為一種雜合的Apo CⅢ突變體(R19X)人群血漿Apo CⅢ和TG下降。同時，其血管造影證實的冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生率明顯低于對照人群。研究［12］結(jié)果表明，Apo CⅢ的R19X突變是一個有益突變。家族性高三酰甘油血癥(familial hypertriglyceridemia，F(xiàn)HTG)是一種常染色體顯性遺傳性疾病，在一般人群中患病率為1/400～1/300，其血漿三酰甘油濃度通常為 300～800 mg/dL［13］，而Apo CIII轉(zhuǎn)基因小鼠血漿TG濃度是正常對照的5～10倍［14］，在普通喂養(yǎng)的條件下其TG濃度可達(dá)到300 mg/dL 以上［14］。

本研究應(yīng)用Apo CIII轉(zhuǎn)基因小鼠，建立了經(jīng)母系遺傳的嚴(yán)重HTG后代，同時獲得血漿三酰甘油水平正常的陰性的同窩對照后代。Apo CIII轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的嚴(yán)重HTG按照孟德爾規(guī)律遺傳，母系的后代中基本是一半為正常，一半為Apo CIII轉(zhuǎn)基因的嚴(yán)重HTG。MT及MC組小鼠出生體質(zhì)量及生長速度均與NC組小鼠差異常無統(tǒng)計學(xué)意義，顯示Apo CIII轉(zhuǎn)基因造成的雌鼠嚴(yán)重HTG對后代不同基因型的個體發(fā)育沒有明顯影響。

然而，本研究組發(fā)現(xiàn)，MT組的TG和TC濃度在哺乳期和離乳后比MC及NC非常顯著增高，而MC及NC TG及TC濃度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。母系遺傳HTG幼年小鼠(MT)的糖耐量異常、空腹胰島素水平較MC、NC組明顯增高，對血漿空腹葡萄糖濃度沒有影響;根據(jù)血漿空腹胰島素和血糖水平計算的HOMA-RI依然是MT組最高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示，Apo CIII轉(zhuǎn)基因的嚴(yán)重HTG母親對幼年后代的糖脂代謝的影響只針對于轉(zhuǎn)基因后代。糖尿病患者經(jīng)常伴有脂代謝異常(HTG和低HDL為主)［15］。其原因可能是，胰島素抵抗可明顯促進(jìn)肝臟VLDL的合成和分泌形成HTG，但原發(fā)性HTG對糖代謝的影響尚不明確。Pollex等［16］發(fā)現(xiàn)，一種LPL基因突變?nèi)巳?LPL291)的HTG與2型糖尿病有正相關(guān)性，也意味著HTG可能會導(dǎo)致糖代謝異常。筆者之前的實驗研究［5］發(fā)現(xiàn)，LPL基因缺陷導(dǎo)致的嚴(yán)重 HTG小鼠有明顯的一相胰島素分泌減少，且在高齡期發(fā)生胰島素抵抗和胰腺β細(xì)胞增生。結(jié)合本研究新發(fā)現(xiàn)的母系遺傳HTG可以促進(jìn)胰島素抵抗，說明不同原因的原發(fā)性HTG是有可能對糖代謝產(chǎn)生一定影響的。然而，Reaven等［17］曾經(jīng)應(yīng)用相同嚴(yán)重HTG的Apo CIII轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)在正常條件和鏈霉硫脲(streptozocin，STZ)誘發(fā)糖尿病后，其機(jī)體糖代謝改變與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈蟛町悷o統(tǒng)計學(xué)意義。而本研究發(fā)現(xiàn)母系遺傳的嚴(yán)重HTG會影響幼年后代糖代謝。由于在轉(zhuǎn)基因動物的繁育中，通常是以轉(zhuǎn)基因父本與非轉(zhuǎn)基因母本交配而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代，或混合了母系和父系遺傳的轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行研究，因此，未來有必要進(jìn)一步研究經(jīng)母系和父系遺傳的HTG對后代糖脂的代謝影響有無差異。

本研究雖然未能對母系遺傳HTG促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探索，但表觀遺傳很有可能起到重要作用。表觀遺傳現(xiàn)象發(fā)生在環(huán)境因素和基因組的互作界面，如ApoE基因缺陷小鼠母親的高膽固醇血癥導(dǎo)致基因組某些區(qū)域的基因甲基化和/或染色質(zhì)的修飾從而引起膽固醇合成的基因影響胚胎的通過誘導(dǎo)甲基化或去甲基化活性的增加，對基因組某些區(qū)域進(jìn)行了修飾，從而增加了后代對動脈粥樣硬化的易感性［18-20］。這些發(fā)現(xiàn)表明，母親體內(nèi)環(huán)境的負(fù)性改變導(dǎo)致了胚胎中某些基本的細(xì)胞過程發(fā)生了重編程，由此可能導(dǎo)致母系和父系遺傳對后代的不同作用，而確切機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究，如果在嚴(yán)重HTG患者中母系遺傳也會影響后代的糖代謝，這對臨床實踐是有指導(dǎo)意義的。

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