血管緊張素1-7降低脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激增加脂聯(lián)素表達(dá)

劉 暢 曹 曦 楊芳遠(yuǎn) 張雪蓮 袁明霞 楊金奎

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100730)

近十年來(lái)，關(guān)于腎素－血管緊張素(renin-angiotensin system，RAS)系統(tǒng)抑制劑的研究都是圍繞著其在高危人群中延緩2型糖尿病發(fā)生的臨床作用［1］。同時(shí)，RAS的幾個(gè)新的成員血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)，血管緊張素(1－7)［angiotension(1－7)，Ang-(1－7)］、Mas受體等也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。2002年，研究者［2］發(fā)現(xiàn)了Ang-(1－7)的特異性受體Mas，使RAS從傳統(tǒng)的ACE-AngⅡ-AT1軸擴(kuò)展出新的ACE2-Ang-(1－7)-Mas軸，為心血管疾病及糖代謝異常疾病的治療提供了新的靶點(diǎn)。ACE2可以降解AngⅡ?yàn)锳ng-(1－7)對(duì)于傳統(tǒng)的RAS系統(tǒng)有負(fù)性調(diào)節(jié)的作用，Ang-(1－7)通過(guò)Mas受體與AngⅡ起相反的作用。

在外周組織中，AngⅡ可以通過(guò)增加氧化應(yīng)激的發(fā)生從而誘導(dǎo)胰島素抵抗［3］。AngⅡ可以刺激胞質(zhì)中NADPH氧化酶的表達(dá)增加從而增加細(xì)胞中活性氧(ROS)的水平［4-5］。同時(shí)AngⅡ可以降低脂肪細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞中胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS－1)依賴(lài)的胰島素通路的表達(dá)，通路中各蛋白磷酸化激活及促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT－4)的膜轉(zhuǎn)位［6］。最近的研究［7-8］表明 Ang-(1 －7)可以對(duì)抗AngⅡ的作用從而增加胰島素誘導(dǎo)的Akt的磷酸化。Santos等［7］報(bào)道Mas受體敲除小鼠更易進(jìn)展為代謝綜合征，出現(xiàn)代謝紊亂的臨床表現(xiàn)。以上研究表明Ang-(1－7)在改善胰島素抵抗及維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起到重要作用。然而Ang-(1－7)在脂肪組織和骨骼肌組織中對(duì)于氧化應(yīng)激及其相關(guān)的葡萄糖代謝的作用尚未有報(bào)道。

本研究中，筆者檢測(cè)了ACE2-Ang-(1－7)-Mas軸在對(duì)抗氧化應(yīng)激的損傷及增加脂肪細(xì)胞胰島素敏感性因子脂聯(lián)素的表達(dá)中的作用。Mas受體的拮抗劑A779可以抵消Ang-(1－7)的作用。

1 材料與方法

1.1 脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及預(yù)處理

3T3-L1脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及培養(yǎng):將3T3-L1前脂肪細(xì)胞按80%密度接種在12孔板中，用含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至完全融合2 d后開(kāi)始誘導(dǎo):含有0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松和5 mg/L INS、10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，更換為含有5 mg/L INS、10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，之后用含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，以后每48 h換液1次。誘導(dǎo)8～10 d后90%以上細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型，細(xì)胞內(nèi)充滿(mǎn)大小不等的脂滴，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組:①對(duì)照組;②Ang-(1 －7)10－9組;③Ang-(1 －7)10－9﹢ A779 10－6組;④葡萄糖氧化酶(GO)50 mU/mL;⑤GO 100 mU/mL;⑥GO 100 mU/mL+Ang-(1 －7)10－9組。

1.2 活性氧(ROS)熒光探針-DHE檢測(cè)細(xì)胞ROS的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)采用ROS熒光探針-DHE，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)INS－1細(xì)胞ROS的表達(dá)。流式細(xì)胞分析操作方法為采用480～535 nm波長(zhǎng)激發(fā)，測(cè)定590 nm～610 nm以上的發(fā)射，細(xì)胞可以分成2個(gè)亞群:ROS陰性細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，ROS陽(yáng)性細(xì)胞有較強(qiáng)的紅色熒光。其工作濃度為1 μmol/L。

DHE染色步驟:①準(zhǔn)備好上述細(xì)胞及DHE染色液。用PBS溶液將DHE原液稀釋至工作濃度，為1 μmol/L。②上述細(xì)胞用PBS液漂洗2～3次后，除空白對(duì)照組外，其余各組均加入2 mL的DHE工作液，37℃溫育20 min。空白對(duì)照組用于流式檢測(cè)的背景對(duì)照。③吸去染色液，PBS漂洗2～3次，每孔加入400 μL胰蛋白酶細(xì)胞消化液，消化1～2 min。④每孔加入預(yù)冷PBS 1 mL，終止消化反應(yīng)，吹打混勻。⑤集細(xì)胞懸液，離心，棄上清。⑥管樣品加入500 μL PBS溶液，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 NBT還原實(shí)驗(yàn)檢測(cè)活性氧

NBT還原實(shí)驗(yàn)檢測(cè)活性氧法作用原理:淡黃色的四氮唑基經(jīng)還原后可以變成紫黑色的甲月簪基，可檢測(cè)其吸光度。

細(xì)胞接種在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為以下幾組:①對(duì)照組;②Ang-(1 －7)10－9組;③Ang-(1 －7)10－9﹢A779 10－6組，每組4個(gè)副孔。每組細(xì)胞在含0.2%NBT的磷酸鹽緩沖液PBS中避光孵育90 min。然后加入50%冰醋酸溶液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)560 nm各組的吸光度OD值。在倒置顯微鏡下顯色并拍照。

1.4 提取RNA，反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR

1)RNA提取:將細(xì)胞培養(yǎng)瓶從孵箱取出，鏡下觀察細(xì)胞分化程度、狀態(tài)等，吸出培養(yǎng)液。用PBS洗3次。Trizol 1 mL吹起細(xì)胞，移至無(wú)RNA酶的EP管中，室溫5 min，充分裂解。加入氯仿0.2 mL用手用力震蕩 15 s，冰上靜置 10 min。4離心 12 000 g，15 min。小心吸上清于新管中，0.5 mL的異丙醇輕輕顛倒震蕩冰上靜置 15 min。4℃離心 12 000 g，15 min。棄上清，沉淀中加75%的乙醇(溶于DEPC水中)顛倒混勻，4℃離心7 400 g，10 min。棄上清，風(fēng)干沉淀5～10 min去乙醇。重新溶解沉淀于15～20 μL DEPC水中。－70℃保存。

2)反轉(zhuǎn)錄:RNA的熱變性:RNase Free H2O210 μL;Oligo(dT)20(10 pmol/ μL)1 μL;Total RNA 2 μg;65 ℃，5 min;置于冰上。

反應(yīng)液配置:第1步變性后的RNA溶液12 μL;5× RT Buffer 4 μL;dNTP Mixture(各 10 mmol/L)2 μL;RNase Inhibitor(10U/ μL)1 μL;Rever Tra Ace 1 μL;總體積 20 μL。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):30℃ 10 min→42℃ 20 min→99℃ 5 min→4℃ 5 min→ 瞬間離心。片段較長(zhǎng)時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)此步驟時(shí)間(20～60 min)。由于反轉(zhuǎn)錄酶在反應(yīng)后和cDNA結(jié)合，所以在99℃下進(jìn)行5 min的熱處理。

3)實(shí)時(shí)定量PCR

反應(yīng)液的配制:蒸餾水16 μL，SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 25 μL，上游引物(10 μmol/L)2 μL，下游引物(10μmol/L)2μL，樣品溶液 5 μL，總體積 50 μL，體系:15 μL(兩步法，退火/延伸溫度 60℃)，PCR循環(huán)(×40循環(huán)):95℃ 15 s→60℃ 60 s。

4)所用引物:

TNF-α:5'-CGTCGTAGCAAACCACCAAG-3';5'-TTGAAGAGAACCTGGGAGTAGACA-3';IL-6:5'-TGGGAAATCGTGGAAATGAG-3'; 5'-CTCTGAAGGACT CTGGCTTTG-3';Adiponectin:5'-TGGAGAGAAGGGAGAGAAAGG-3';5'-TGGTCGTAGGTGAAGAGAACG-3';18S:5'-TCAAGAACGAAAGTCGGAGG-3';5'-GGACATCTAAGGGCATCACA-3'。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)資料均采用SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異采用One-way ANOVA分析檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ang-(1－7)減少成熟脂肪細(xì)胞ROS水平

DHE探針結(jié)合后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)成熟脂肪細(xì)胞中ROS水平，結(jié)果顯示:Ang-(1－7)可以減少成熟脂肪細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度即ROS水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而Mas受體拮抗劑A779可以逆轉(zhuǎn)這種作用(P＜0.01)(圖1，表1)。

表1 各組脂肪細(xì)胞DHE染色熒光強(qiáng)度Tab.1 DHE intensity of each group(±s)(n=3)

表1 各組脂肪細(xì)胞DHE染色熒光強(qiáng)度Tab.1 DHE intensity of each group(±s)(n=3)

＊＊P ＜0.001 vs control group;DEH:dihydroethidium.

Group DHE intensity Control 1.00 ±0.02 Ang－ (1 －7) 0.81 ±0.04＊＊Ang－(1 －7)+A779 1.05 ±0.03＊＊

圖1 各組脂肪細(xì)胞DHE染色熒光強(qiáng)度Fig.1 DHE intensity of each group(n＞3)

經(jīng)NBT還原實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)NBT還原后的吸光度，結(jié)果顯示，Ang-(1－7)可以減少成熟脂肪細(xì)胞NBT還原后的吸光度即ROS的產(chǎn)生水平(P＜0.001)，而Mas受體拮抗劑A779可以逆轉(zhuǎn)這種作用(P ＜0.05)(圖2，表2)。

圖2 各組脂肪細(xì)胞NBT染色OD(560)值Fig.2 NBT reduction OD(560)of each group(n=7)NBT:tetranitroblue tetrozolium chloride.

表2 各組脂肪細(xì)胞NBT染色OD(560)值Tab.2 NBT reduction OD(560)of each group (x ± s，n=7)

2.2 氧化應(yīng)激降低脂聯(lián)素的mRNA表達(dá)

分別在分化成熟的脂肪細(xì)胞中加入50 mU/mL及100 mU/mL的GO培養(yǎng)12 h建立氧化應(yīng)激的濃度梯度模型。定量PCR的方法檢測(cè)脂聯(lián)素的表達(dá)，結(jié)果顯示，脂聯(lián)素的表達(dá)隨GO濃度的增加而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氧化應(yīng)激損傷降低了脂聯(lián)素的表達(dá)從而減少脂肪細(xì)胞的胰島素敏感性增加胰島素抵抗(圖3)。

圖3 各組脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)Fig.3 Adiponectin relative expression of each group(n=8)

2.3 Ang-(1－7)通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平從而增加脂聯(lián)素的mRNA表達(dá)

在已建立的氧化應(yīng)激模型中加入Ang-(1－7)及A779分別檢測(cè)脂聯(lián)素的表達(dá)。結(jié)果顯示，GO濃度為100 mU/mL條件下脂聯(lián)素表達(dá)降低72%(P＜0.05)，同時(shí)加入Ang-(1－7)后可以逆轉(zhuǎn)脂聯(lián)素表達(dá)的減低，脂聯(lián)素的表達(dá)升高了10倍(P＜0.05)。單獨(dú)加入Ang-(1－7)組脂聯(lián)素的表達(dá)較空白對(duì)照組升高了9.27倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)加入Ang-(1－7)及A779組脂聯(lián)素的表達(dá)顯著下降(P＜0.05)(圖4)。

2.4 Ang-(1－7)對(duì)炎性反應(yīng)因子IL-6和 TNF-α的mRNA表達(dá)的影響

圖4 各組脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)Fig.4 Adiponectin relative expression of each group (n=3)

實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)Ang-(1－7)及A779對(duì)其他與脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激及葡萄糖攝取相關(guān)炎性反應(yīng)因子IL-6和TNF-α的mRNA水平表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，Ang-(1－7)及 A779對(duì)于 IL-6和 TNF-α的mRNA水平表達(dá)沒(méi)有顯著性影響(P＞0.05)(圖5、6，表3、4)。

圖5 各組脂肪細(xì)胞中炎性反應(yīng)因子IL-6 mRNA表達(dá)Fig.5 IL-6 relative expression of each group(n=3)

圖6 各組脂肪細(xì)胞中炎性反應(yīng)因子TNF-α mRNA表達(dá)Fig.6 TNF-α relative expression of each group(n=3)

表3 各組脂肪細(xì)胞中炎性反應(yīng)因子IL-6 mRNA表達(dá)Tab.3 IL-6 relative expression of each group(x ± s，n=3)

表4 各組脂肪細(xì)胞中炎性反應(yīng)因子TNF-α mRNA表達(dá)Tab.4 TNF-α relative expression of each group(x ± s，n=3)

3 討論

氧化應(yīng)激在2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中起到關(guān)鍵作用［9-10］。多項(xiàng)臨床和亞臨床的研究［11-12］指出氧化應(yīng)激在2型糖尿病發(fā)生的病理過(guò)程中起關(guān)鍵作用。氧自由基和過(guò)氧化氫作為兩個(gè)強(qiáng)氧化劑被稱(chēng)為活性氧(ROS)，在血糖失衡及靶器官損傷中起作用。氧化應(yīng)激可以減低外周組織對(duì)胰島素的敏感性并且降低血糖的代謝利用。在本研究中，筆者首次提出外源性的Ang-(1－7)處理可以減少分化成熟的脂肪細(xì)胞中ROS的水平。

胰島素抵抗是細(xì)胞或組織對(duì)于胰島素作用低于正常生理水平的狀態(tài)，也是2型糖尿病的特征［13-14］。脂肪組織是餐后血糖首先作用的器官［15-16］。最近一項(xiàng)研究［7］表明Mas受體敲除小鼠更易出現(xiàn)以胰島素敏感性降低為特征的胰島素抵抗，葡萄糖耐量受損及脂肪組織葡萄糖攝取率下降。提示Ang-(1－7)/Mas軸可作為胰島素增敏劑而起作用。

雖然TNF-α和IL-6的mRNA水平表達(dá)沒(méi)有顯著性變化，但是Ang-(1－7)處理組顯示出脂聯(lián)素mRNA水平顯著性的增高。脂聯(lián)素是一種血漿細(xì)胞因子，它在脂代謝、胰島素敏感性及抗炎過(guò)程中起到調(diào)節(jié)的作用［17-18］。降低的血清的脂聯(lián)素水平是在人和動(dòng)物體內(nèi)出現(xiàn)肥胖和胰島素抵抗的共同特征［19］。這些結(jié)果指出了Ang-(1－7)可以通過(guò)增加脂聯(lián)素的基因表達(dá)水平從而改善脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗。另外，分化成熟的脂肪細(xì)胞表現(xiàn)出隨著過(guò)氧化氫濃度增高脂聯(lián)素表達(dá)降低的狀態(tài)，并且氧化損傷對(duì)于脂聯(lián)素的表達(dá)起到負(fù)調(diào)節(jié)作用［20］。

在本研究中，筆者提出Ang-(1－7)抵抗氧化應(yīng)激并同時(shí)升高脂聯(lián)素的表達(dá)水平。由葡萄糖氧化酶有誘導(dǎo)的輕微的氧化損傷可以顯著的降低脂聯(lián)素的mRNA水平表達(dá)，并且這種降低是劑量依賴(lài)性的。因此，Ang-(1－7)通過(guò)增加脂聯(lián)素的表達(dá)從而對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷也可能成為Ang-(1－7)改善胰島素抵抗的一個(gè)可能機(jī)制。

脂肪組織作為一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官在糖類(lèi)及脂代謝過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用［21］，很多RAS通路的成員都在脂肪組織中表達(dá)［22］。研究［23］表明 Ang-(1－7)可以對(duì)抗Ang-II的作用，并且作為ACE的抑制劑。Ang-II可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激增加胰島素抵抗。Ang-(1－7)，在RAS中作為Ang-II的對(duì)抗劑，有可能參與到抗氧化應(yīng)激減少胰島素抵抗的過(guò)程中，并在其中起到保護(hù)的作用。另外，Ang-(1－7)/Mas軸可以在脂肪組織、肝臟、骨骼肌、內(nèi)皮細(xì)胞及心臟中激活磷酸肌醇－3激酶 (PI3K)/Akt信號(hào)通路，此信號(hào)通路的激活也可能成為Ang-(1－7)/Mas軸的作用機(jī)制。Ang-(1－7)/Mas軸可以誘導(dǎo)脂肪組織中Akt蘇氨酸(308)和絲氨酸 (473)位點(diǎn)磷酸化，從而激活胰島素作用通路，增加葡萄糖的攝取。選擇性Mas受體拮抗劑A779可以阻斷Ang-(1－7)誘導(dǎo)活化的PI3K/Akt信號(hào)通路。對(duì)果糖喂養(yǎng)的代謝綜合征大鼠模型進(jìn)行慢性持續(xù)注射Ang-(1－7)治療，可以重新激活脂肪細(xì)胞中IR/IRS－1/PI3K/Akt信號(hào)通路，使其正?；＿@些結(jié)果表明，Ang-(1－7)增加葡萄糖攝取的機(jī)制中包括其對(duì)于胰島素作用信號(hào)通路的激活。

總之，本研究表明Ang-(1－7)可以通過(guò)Mas受體對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷從而增加脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的表達(dá)，最終增加外周組織脂肪細(xì)胞的敏感性。其主要機(jī)制包括Ang-(1－7)可以通過(guò)Mas受體降低ROS的產(chǎn)生及促進(jìn)胰島素敏感性因子脂聯(lián)素的表達(dá)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［7］Mas受體敲除小鼠易發(fā)生胰島素抵抗和本研究結(jié)果，可以得出Ang-(1－7)通過(guò)Mas受體可以對(duì)抗氧化應(yīng)激，其機(jī)制至少包括對(duì)抗氧化應(yīng)激和增加脂聯(lián)素表達(dá)過(guò)程兩方面。

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