松茸菌絲體液體培養(yǎng)方式及其最適培養(yǎng)基的篩選

張麗+郭成金

摘要：首次通過對(duì)松茸菌絲體的液體培養(yǎng)方式的比較，選擇以間歇性手搖的方式進(jìn)行篩選，以松茸菌絲體生物量（干質(zhì)量）為主要指標(biāo)，首先采用單因素試驗(yàn)分別篩選出2種最適碳氮源，再結(jié)合L9（34）正交設(shè)計(jì)方法，最終得到最適液體培養(yǎng)基配方：蔗糖30.00 g/L，麥芽糖20.00 g/L，酵母粉2.50 g/L，麥麩25.00 g/L（浸提液），KH2PO4 2.50 g/L，MgSO4·7H2O 1.50 g/L，維生素B1 8 mg/L，pH值自然條件。25 ℃靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)72 h，其生物量可達(dá)10.92 g/L。與前人試驗(yàn)結(jié)果相比，該方式周期更短，生物量更高。

關(guān)鍵詞：松茸；間歇性手搖；菌絲體；生物量；液體培養(yǎng)基；正交設(shè)計(jì)；周期。

中圖分類號(hào)：S646.1+50.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0245-03

松茸[Tricholoma matsutake （S. Ito & S. Imai） Singer]別稱松口蘑，屬擔(dān)子菌門傘菌亞門傘菌綱傘菌亞綱傘菌目口蘑科口蘑屬^[1]，是一種珍稀瀕危的食藥用真菌，國(guó)家級(jí)二級(jí)保護(hù)植物，有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值^[2]。松茸是共生菌，世界范圍內(nèi)研究松茸人工栽培已有幾十年的歷史，然而至今仍無突破性的成果。目前，隨著松茸生理生態(tài)研究的深入，松茸菌絲的純培養(yǎng)及子實(shí)體的仿生態(tài)栽培已取得了一定的進(jìn)展，但僅能做到接種式的半人工栽培，真正的人工栽培還沒有實(shí)現(xiàn)^[3-4]。目前，很多國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用高新技術(shù)從分子生物學(xué)角度研究松茸外生菌根的形成機(jī)理、分子特性和它們的遺傳特征序列^[5-8]，以此作為分子標(biāo)記，既可研究松茸的起源和親緣關(guān)系，又可為建立松茸基因庫(kù)打下基礎(chǔ)，以備將來用以挽救其可能滅絕的命運(yùn)^[3]。自日本學(xué)者洪田捻（1947）、廣江勇（1957）和小川真（1987）等先后報(bào)道了分離培養(yǎng)松茸菌絲體的方法、培養(yǎng)基、菌落形態(tài)和菌絲類型^[9]并為松茸菌種分離提供了成功的經(jīng)驗(yàn)以來，人們采用不同的方法從不同的角度對(duì)松茸菌絲體純培養(yǎng)^[10-11]、液體發(fā)酵^[12-13]等進(jìn)行了許多研究，通過對(duì)松茸菌絲體的獲得、擴(kuò)繁及其鑒定證實(shí)了在合理控制試驗(yàn)條件下可以進(jìn)行松茸菌絲體液體擴(kuò)繁，且擴(kuò)繁后的菌絲體與原種依然保持種質(zhì)的一致性^[14]。筆者運(yùn)用不同于前人的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過碳氮源單因素試驗(yàn)，并結(jié)合L9（34）正交設(shè)計(jì)對(duì)松茸菌絲體最適液體培養(yǎng)基進(jìn)行了系統(tǒng)的篩選，為松茸液體發(fā)酵及今后的育種等提供了理論依據(jù)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

松茸，由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供，編號(hào)為ACC51071。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 綜合培養(yǎng)基 棉籽皮200.00 g/L（浸提液）、馬鈴薯200.00 g/L（浸提液）、葡萄糖20.00 g/L、KH2PO4 3.00 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、維生素B1 0.004 g/L、瓊脂18.00 g/L，pH值自然條件。

1.2.2 碳源初選培養(yǎng)基 酵母粉3.00 g/L，KH2PO4 3.00 g/L，MgSO4·7H2O 1.50 g/L，維生素B1 0.004 g/L，pH值自然條件。分別以葡萄糖 20.00 g/L、麥芽糖 20.00 g/L、蔗糖 20.00 g/L、馬鈴薯200.00 g/L（浸提液）、玉米20.00 g/L（浸提液）為供試碳源。

1.2.3 氮源初選培養(yǎng)基 葡萄糖20.00 g/L，KH2PO4 3.00 g/L，MgSO4·7H2O 1.50 g/L，維生素B1 4 mg/L，pH值自然。分別以酵母粉3.00 g/L、蛋白胨3.00 g/L、牛肉膏3.00 g/L、硝酸銨3.00 g/L、麥麩20.00 g/L（浸提液）為供試氮源。

1.3 試劑與儀器設(shè)備

SW-CJ-2FD 雙人單面凈化工作臺(tái)（江蘇蘇州凈化設(shè)備有限公司）；YXQG02手提式壓力蒸汽消毒器（山東新華醫(yī)療器械廠）；WDP型微生物多用培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；BS224S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)股份有限公司）；AP-01D 真空泵（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化與提純復(fù)壯 將保存的松茸菌種提前3 d活化，在無菌條件下接種于斜面綜合培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng) 5 d，再挑取健壯的菌絲前端，接種于平板綜合培養(yǎng)基上，于 25 ℃ 培養(yǎng) 6 d，備用。

1.4.2 菌絲體液體培養(yǎng) 用打孔器在生長(zhǎng)健壯的菌絲體前端，挑取大小相同約0.5 cm2的菌塊，接種于液體培養(yǎng)基中，每瓶5塊。25 ℃靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)72 h，每個(gè)水平3次重復(fù)。

1.4.3 菌絲體干質(zhì)量測(cè)量 濾紙編號(hào)，分別用電子天平稱重，將培養(yǎng)84 h的松茸菌絲體抽濾后，于60 ℃烘箱中烘干至恒重，用電子天平再次稱重。

1.4.4 碳氮源培養(yǎng)基正交試驗(yàn) 依據(jù)碳源、氮源單因素試驗(yàn)的結(jié)果，各選擇2個(gè)較好的碳氮源，按L9（34）設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)（表1）進(jìn)行復(fù)選，與KH2PO4 3.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、維生素B1 0.004 g/L組成9個(gè)試驗(yàn)配方，篩選出最佳碳氮源組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同液體培養(yǎng)方式對(duì)松茸菌絲體生長(zhǎng)狀況的影響endprint

試驗(yàn)初期筆者首次進(jìn)行了3種液體培養(yǎng)方式的篩選，分別為靜置培養(yǎng)（圖1-a）、120 r/min搖床培養(yǎng)（圖1-b）和間歇性手搖培養(yǎng)（圖1-c），各72 h。由于松茸菌絲生長(zhǎng)迅速，靜置培養(yǎng)12 h后菌絲體即可連成片，浮于液體表面，抽濾后菌絲體生物量誤差較大，且不利于獲取菌絲體片段。搖床培養(yǎng)的液體渾濁，菌絲細(xì)小黏稠，不宜抽濾和分離。間歇性手搖是接種后靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)一段時(shí)間后的菌絲體分布均勻，清晰可見，較容易抽濾，且動(dòng)靜相間法所培養(yǎng)的菌絲體更有利于原生質(zhì)體的制備和誘變育種^[15]，所以最終采取間歇性手搖方式進(jìn)行后期試驗(yàn)。

2.2 不同碳源對(duì)松茸菌絲體生物量的影響

碳源是構(gòu)成細(xì)胞基本骨架的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也為基本生命過程提供能源，試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，在5種供試碳源中，以蔗糖為碳源的菌絲體生物量最高，麥芽糖次之，再次為葡萄糖、玉米粒，馬鈴薯最低。統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析結(jié)果（表4）表明，F(xiàn)值為14.478>F0.01（4，10）=5.994^[16]，表明不同碳源培養(yǎng)基對(duì)松茸菌絲體生物量的影響在0.01水平上差異顯著。Duncans

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，松茸菌絲體生長(zhǎng)的最適液體培養(yǎng)基為蔗糖30.00 g/L、麥芽糖20.00 g/L、酵母粉2.50 g/L、麥麩 25.00 g/L（浸提液）、KH2PO4 2.50 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、維生素B1 8 mg/L，pH值自然條件。25 ℃靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h 水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)72 h，其生物量可達(dá) 10.92 g/L，與前人試驗(yàn)結(jié)果相比，本研究周期更短，生物量更高。采用間歇性手搖的方式培養(yǎng)，得到的菌絲體分散均勻，生物量高，便于日后的原生質(zhì)體制備和誘變育種。

參考文獻(xiàn)：

[1]戴玉成，楊祝良. 中國(guó)藥用真菌名錄及部分名稱的修訂[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2008，27（6）：801-824.

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[11]曹張軍，張興群，呂小鷹，等. 一個(gè)適合松茸菌絲生長(zhǎng)的加富培養(yǎng)基[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2007，14（3）：41-43.

[12]李長(zhǎng)田，刁盈盈，毛欣欣，等. 松茸液態(tài)發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)量因子的研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2012，31（2）：229-234.

[13]王淑珍，白 晨，高 雁，等. 松茸液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選與科學(xué)依據(jù)[J]. 食用菌，2000，22（6）：4-5.

[14]張微思，羅孝坤，張麗英，等. 松茸菌絲體的純培養(yǎng)及其鑒定[J]. 中國(guó)食用菌，2010，29（3）：34-36.

[15]曲鴻雁，郭成金.冬蟲夏草與蛹蟲草融合子菌絲體液體培養(yǎng)基篩選[J]. 中國(guó)釀造，2013，32（3）：106-109.

[16]杜榮騫.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)[M]. 北京：高等教育出版社，2003：263-265.

[17]曾東方，陳 玢，高孟文. 不同氮源對(duì)松茸菌絲生長(zhǎng)的影響[J]. 食用菌，2010，32（4）：10-11.

[18]趙秀芳. 不同碳氮源對(duì)松口蘑菌絲生長(zhǎng)的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（3）：429-429，431.

[19]劉西周，郭成金. 采用L9（34）正交設(shè)計(jì)方法篩選血耳菌絲體液體培養(yǎng)基[J]. 中國(guó)食用菌，2009，28（1）：36-38.

[20]楊民和，楊新美，陳立國(guó).松茸的營(yíng)養(yǎng)生理及培養(yǎng)基的篩選[J]. 菌物系統(tǒng)，2000，19（2）：272-277.endprint

試驗(yàn)初期筆者首次進(jìn)行了3種液體培養(yǎng)方式的篩選，分別為靜置培養(yǎng)（圖1-a）、120 r/min搖床培養(yǎng)（圖1-b）和間歇性手搖培養(yǎng)（圖1-c），各72 h。由于松茸菌絲生長(zhǎng)迅速，靜置培養(yǎng)12 h后菌絲體即可連成片，浮于液體表面，抽濾后菌絲體生物量誤差較大，且不利于獲取菌絲體片段。搖床培養(yǎng)的液體渾濁，菌絲細(xì)小黏稠，不宜抽濾和分離。間歇性手搖是接種后靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)一段時(shí)間后的菌絲體分布均勻，清晰可見，較容易抽濾，且動(dòng)靜相間法所培養(yǎng)的菌絲體更有利于原生質(zhì)體的制備和誘變育種^[15]，所以最終采取間歇性手搖方式進(jìn)行后期試驗(yàn)。

2.2 不同碳源對(duì)松茸菌絲體生物量的影響

碳源是構(gòu)成細(xì)胞基本骨架的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也為基本生命過程提供能源，試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，在5種供試碳源中，以蔗糖為碳源的菌絲體生物量最高，麥芽糖次之，再次為葡萄糖、玉米粒，馬鈴薯最低。統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析結(jié)果（表4）表明，F(xiàn)值為14.478>F0.01（4，10）=5.994^[16]，表明不同碳源培養(yǎng)基對(duì)松茸菌絲體生物量的影響在0.01水平上差異顯著。Duncans

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，松茸菌絲體生長(zhǎng)的最適液體培養(yǎng)基為蔗糖30.00 g/L、麥芽糖20.00 g/L、酵母粉2.50 g/L、麥麩 25.00 g/L（浸提液）、KH2PO4 2.50 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、維生素B1 8 mg/L，pH值自然條件。25 ℃靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h 水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)72 h，其生物量可達(dá) 10.92 g/L，與前人試驗(yàn)結(jié)果相比，本研究周期更短，生物量更高。采用間歇性手搖的方式培養(yǎng)，得到的菌絲體分散均勻，生物量高，便于日后的原生質(zhì)體制備和誘變育種。

參考文獻(xiàn)：

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[3]周選圍. 松茸資源研究概況[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2002，9（1）：50-56.

[4]邵麗麗，王艷臣，羅春玲. 松口蘑研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J]. 中國(guó)林副特產(chǎn)，2009，101（4）：109-110.

[5]Vaario L M，Heinonsalo J，Spetz P，et al. The ectomycorrhizal fungus Tricholoma matsutake is a facultative saprotroph in vitro[J]. Mycorrhiza，2012，22（6）：409-418.

[6]Kataoka R，Siddiqui Z A，Kikuchi J，et al. Detecting nonculturable bacteria in the active mycorrhizal zone of the pine mushroom Tricholoma matsutake[J]. Journal of Microbiology，2012，50（2）：199-206.

[7]Vaario L M，F(xiàn)ritze H，Spetz P，et al.Tricholoma matsutake dominates diverse microbial communities in different forest soils[J]. Appl Environ Microbiol，2011，77（24）：8523-8531.

[8]Ding X，Hou Y L. Identification of genetic characterization and volatile compounds of Tricholoma matsutake from different geographical origins[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2012，44（44）：233-239.

[9]劉振欽，高勇秀，王子權(quán). 松茸菌絲體分離培養(yǎng)研究初報(bào)[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，11（2）：13-16，120.

[10]Hirato H，Kitamoto Y. Effect of physico-chemical characteristics of the culture substrate and nutritional conditions on mycelial growth in Tricholoma matsutake[J]. Mushroom Sci Biotechnol，1995（2）：17-22.

[11]曹張軍，張興群，呂小鷹，等. 一個(gè)適合松茸菌絲生長(zhǎng)的加富培養(yǎng)基[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2007，14（3）：41-43.

[12]李長(zhǎng)田，刁盈盈，毛欣欣，等. 松茸液態(tài)發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)量因子的研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2012，31（2）：229-234.

[13]王淑珍，白 晨，高 雁，等. 松茸液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選與科學(xué)依據(jù)[J]. 食用菌，2000，22（6）：4-5.

[14]張微思，羅孝坤，張麗英，等. 松茸菌絲體的純培養(yǎng)及其鑒定[J]. 中國(guó)食用菌，2010，29（3）：34-36.

[15]曲鴻雁，郭成金.冬蟲夏草與蛹蟲草融合子菌絲體液體培養(yǎng)基篩選[J]. 中國(guó)釀造，2013，32（3）：106-109.

[16]杜榮騫.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)[M]. 北京：高等教育出版社，2003：263-265.

[17]曾東方，陳 玢，高孟文. 不同氮源對(duì)松茸菌絲生長(zhǎng)的影響[J]. 食用菌，2010，32（4）：10-11.

[18]趙秀芳. 不同碳氮源對(duì)松口蘑菌絲生長(zhǎng)的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（3）：429-429，431.

[19]劉西周，郭成金. 采用L9（34）正交設(shè)計(jì)方法篩選血耳菌絲體液體培養(yǎng)基[J]. 中國(guó)食用菌，2009，28（1）：36-38.

[20]楊民和，楊新美，陳立國(guó).松茸的營(yíng)養(yǎng)生理及培養(yǎng)基的篩選[J]. 菌物系統(tǒng)，2000，19（2）：272-277.endprint

試驗(yàn)初期筆者首次進(jìn)行了3種液體培養(yǎng)方式的篩選，分別為靜置培養(yǎng)（圖1-a）、120 r/min搖床培養(yǎng)（圖1-b）和間歇性手搖培養(yǎng)（圖1-c），各72 h。由于松茸菌絲生長(zhǎng)迅速，靜置培養(yǎng)12 h后菌絲體即可連成片，浮于液體表面，抽濾后菌絲體生物量誤差較大，且不利于獲取菌絲體片段。搖床培養(yǎng)的液體渾濁，菌絲細(xì)小黏稠，不宜抽濾和分離。間歇性手搖是接種后靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)一段時(shí)間后的菌絲體分布均勻，清晰可見，較容易抽濾，且動(dòng)靜相間法所培養(yǎng)的菌絲體更有利于原生質(zhì)體的制備和誘變育種^[15]，所以最終采取間歇性手搖方式進(jìn)行后期試驗(yàn)。

2.2 不同碳源對(duì)松茸菌絲體生物量的影響

碳源是構(gòu)成細(xì)胞基本骨架的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也為基本生命過程提供能源，試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，在5種供試碳源中，以蔗糖為碳源的菌絲體生物量最高，麥芽糖次之，再次為葡萄糖、玉米粒，馬鈴薯最低。統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析結(jié)果（表4）表明，F(xiàn)值為14.478>F0.01（4，10）=5.994^[16]，表明不同碳源培養(yǎng)基對(duì)松茸菌絲體生物量的影響在0.01水平上差異顯著。Duncans

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，松茸菌絲體生長(zhǎng)的最適液體培養(yǎng)基為蔗糖30.00 g/L、麥芽糖20.00 g/L、酵母粉2.50 g/L、麥麩 25.00 g/L（浸提液）、KH2PO4 2.50 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、維生素B1 8 mg/L，pH值自然條件。25 ℃靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h 水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)72 h，其生物量可達(dá) 10.92 g/L，與前人試驗(yàn)結(jié)果相比，本研究周期更短，生物量更高。采用間歇性手搖的方式培養(yǎng)，得到的菌絲體分散均勻，生物量高，便于日后的原生質(zhì)體制備和誘變育種。

參考文獻(xiàn)：

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[2]弓明欽，王鳳珍. 從國(guó)際松茸市場(chǎng)動(dòng)向看國(guó)產(chǎn)松茸的應(yīng)對(duì)措施[J]. 國(guó)土與自然資源研究，2004，02（2）：88-89.

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