1，25—（OH）2—D3對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管間質(zhì)巨噬細胞趨化抑制因子及核轉(zhuǎn)錄因子κB/P65表達的影響

龍艷君+楊小翠+楊霞+達靜靜+袁靜+田茂露+查艷

[摘要] 目的 觀察巨噬細胞趨化抑制因子（MIF）及核轉(zhuǎn)錄因子κB/P65（NF-κB/P65）在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管間質(zhì)中的表達及1，25-（OH）2-D3對其的影響。 方法 采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)建立單側(cè)輸尿管梗阻模型。將健康成年的雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為3組：假手術(shù)組（n=10）、模型組（n=10）和VD組（n=10）。VD組采用6 ng/（100 g·d）的1，25-（OH）2-D3干預治療，假手術(shù)組和模型組僅給予等量生理鹽水灌胃8周。觀察3組大鼠第8周腎功能、腎組織病理學改變，免疫組化法檢測單核/巨噬細胞表面特異性標志抗原（ED-1）、NF-κB/P65、MIF在腎組織中的表達。 結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組血肌酐增高（P<0.01），腎間質(zhì)面積/統(tǒng)計場面積增加（P<0.01），腎組織ED-1陽性細胞明顯增加（P<0.01），腎組織MIF的表達顯著升高（P<0.01），NF-κB/P65核陽性細胞明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，VD組大鼠腎組織病理學變化得到一定程度的改善，腎組織ED-1、MIF的表達及NF-κB/P65核陽性細胞明顯減少（P<0.01）。 結(jié)論 單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)MIF的表達和NF-κB/P65的活性明顯增加，1，25-（OH）2-D3可能通過下調(diào)MIF的表達，抑制NF-κB/P65的活性來減輕腎小管間質(zhì)的炎癥反應，改善腎臟纖維化。

[關(guān)鍵詞] 1，25-（OH）2-D3；巨噬細胞趨化抑制因子；核轉(zhuǎn)錄因子κB/P65；腎小管間質(zhì)炎癥反應

[中圖分類號] R692.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）09（b）-0008-05

Effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3 on the expression of macrophage chemotaxis inhibitory factor and nuclear factor-κB/P65 of tubulointerstitial cells in unilateral ureteral ligation operation model rats

LONG Yan-jun1 YANG Xiao-cui2★ YANG Xia1 DA Jing-jing1 YUAN Jing1 TIAN Mao-lu1 ZHA Yan1▲

1.Department of Nephrology，People′s Hospital of Guizhou Province，Guiyang 550002，China；2.The Fourth People′s Hospital of Zunyi City in Guizhou Province，Zunyi 563000，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of macrophage migration inhibitory factor（MIF）and nuclear factor-κB/P65（NF-κB/P65）in the kidneys of unilateral ureteral obstruction（UUO）model rats and the effect of 1，25-dihydroxyvitamin D3 on the xpression. Methods Thirty healthy adult male SD rats were randomly divided into 3 groups：sham operation group（n=10），model group（n=10）and VD group[n=10，UUO rats treated with 6 ng/（100 g·d） 1，25-dihydroxyvitamin D3].The rats in sham group and model group were treated with equal normal saline by lavage for 8 weeks.Serum creatinine，histopatho1ogical change，renal tubulointerstitial macrophage marker antigen（ED-1），NF-κB/P65 and MIF in rats at 8 weeks was measured by immunohistochemistry respectively. Results Serum creatinine，renal interstitial area/statistical field area，the expression of MIF，the amount of NF-κB/P65 nuclear positive cell and ED-1 positive cell in model group was significantly increased compared with that in sham group respectively（P<0.01）. Compared with model group，rat renal histopathological change in VD group had a certain degree of improvement，the expression of MIF，the amount of NF-κB/P65 nuclear positive cell and ED-1 positive cell in VD group was significantly decreased respectively（P<0.01）. Conclusion The expression of MIF and the activition of NF-κB/P65 in UUO rats increase significantly.1，25-dihydroxyvitamin D3 may ameliorate the progression of renal tubulointerstitial inflammation and renal fibrosis by intervene the expression of MIF and decrease the activition of NF-κB/P65.

[Key words] 1，25-dihydroxyvitamin D3；Macrophage chemotaxis inhibitory factor；Nuclear factor-κB/P65；Renal tubulointerstitial inflammation

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）正成為一個全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題[1]。腎小管間質(zhì)炎癥可促進CKD患者腎臟纖維化的進程，導致終末期腎衰竭。巨噬細胞移動抑制因子（MIF）是一種強有力的炎癥前細胞因子[2]，可引起核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的活化。在鼠的抗腎小球基底膜腎炎、系膜增生性腎炎、MRL/lpr狼瘡性腎炎等均發(fā)現(xiàn)MIF表達增加[3]，與腎臟組織學損害（間質(zhì)纖維化等）、蛋白尿程度及腎功能衰退密切相關(guān)[4-5]。本研究在單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠模型中觀察腎小管間質(zhì)炎癥反應和腎小管間質(zhì)細胞MIF、NF-κB的表達情況及給予1，25-（OH）2-D3干預后MIF、NF-κB在腎小管間質(zhì)細胞中表達的變化，探討1，25-（OH）2-D3是否通過MIF影響NF-κB活性來改善腎小管間質(zhì)的炎癥反應，為腎纖維化藥物治療提供更廣泛的循證醫(yī)學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

6周左右雄性SD大鼠30只，體重170～220 g，許可合格證號scxk（渝）2007-0005，由重慶試驗動物中心提供。按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組（n=10）、模型組（n=10，行單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)）和1，25-（OH）2-D3干預組（VD組）（n=10，行單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)加1，25-（OH）2-D3 6 ng/（100 g·d）入飲水中灌胃8周）。假手術(shù)組和模型組予等量生理鹽水灌胃。

1.2 動物處理

在UUO術(shù)后8周麻醉大鼠從頸總動脈采血，4℃、3000 r/min離心15 min分離血清，用于測定血肌酐。脫髓處死所有大鼠，剖取左側(cè)腎臟，剝離包膜，部分腎組織10%中性甲醛溶液固定，行組織病理學、免疫組織化學檢測，部分腎組織存放于-80℃，行Real-time PCR和Western blot檢測。

1.3 組織病理學檢測

石蠟切片行常規(guī)HE、PAS和Masson染色，光鏡下雙盲法觀察腎小管間質(zhì)的變化情況。每只大鼠選取3張切片，每張切片隨機選取10個腎小管間質(zhì)視野（避開腎小球和大血管），腎間質(zhì)面積測量在200倍光鏡下，每個視野分別測量腎間質(zhì)面積與統(tǒng)計場面積的比值。采用顯微圖像分析系統(tǒng)（Olympus C3040.ADU）對各組染色結(jié)果進行積分吸光度（A）測定，每張切片隨機選取10個高倍視野（200倍），每個視野代表0.13 mm2的區(qū)域面積，計算其A值，取平均值。

1.4 免疫組織化學檢測

切片脫蠟復水；抗原修復采用微波熱修復，室溫冷卻；經(jīng)3%雙氧水封閉內(nèi)源性酶；正常羊血清封閉15～20 min；加入一抗ED-1（Santa Cruz）1∶50、NF-κB/P65（Cell Signaling Technology）1∶400、MIF（Santa Cruz）1∶50，4℃孵育過夜；滴加HRP Polymer（酶標二抗），在室溫下孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明。實驗同時以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析或q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血肌酐及腎間質(zhì)面積/統(tǒng)計場面積的比較

術(shù)后8周，模型組的血肌酐及腎間質(zhì)面積/統(tǒng)計場面積明顯高于假手術(shù)組及VD組（P<0.01）；VD組的血肌酐及腎間質(zhì)面積/統(tǒng)計場面積明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）（表1）。

表1 3組大鼠血肌酐及腎間質(zhì)面積/統(tǒng)計場面積的比較（x±s，n=10）

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

2.2 3組大鼠腎組織病理檢查結(jié)果

假手術(shù)組腎小管間質(zhì)形態(tài)正常；模型組可見腎小管管腔增大，小管上皮細胞空泡狀變性、萎縮、脫落，腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂、炎癥細胞浸潤及纖維化；VD組腎小管間質(zhì)病變較模型組明顯改善（圖1）。

2.3 3組大鼠腎小管間質(zhì)ED-1的表達情況

免疫組化顯示假手術(shù)組ED-1表達極少；與假手術(shù)組比較，模型組ED-1表達明顯升高（P<0.01），主要表達于腎小管上皮細胞及腎間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)中；與模型組比較，VD組ED-1表達明顯減少（P<0.01）（圖2）。

圖2 3組大鼠腎小管間質(zhì)ED-1的表達情況（×200）

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.VD組；與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

2.4 3組大鼠腎小管間質(zhì)MIF的表達情況

免疫組化顯示假手術(shù)組MIF表達極少；與假手術(shù)組比較，模型組MIF明顯升高（P<0.01），主要表達于腎小管上皮細胞及腎間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)中；與模型組比較，VD組MIF表達明顯減少（P<0.01）（圖3）。

2.5 3組大鼠腎小管間質(zhì)NF-κB/P65的表達情況

免疫組化顯示假手術(shù)組NF-κB/P65在腎小管上皮細胞中主要表達于細胞質(zhì)，未見明顯核陽性細胞；模型組腎小管NF-κB/P65核陽性細胞較假手術(shù)組明顯升高（P<0.01）；VD組腎小管NF-κB/P65核陽性細胞明顯減少（P<0.01）（圖4）。

3 討論

腎臟纖維化，尤其是腎小管間質(zhì)纖維化，幾乎是所有CKD的最終結(jié)果[6]。腎小管間質(zhì)炎癥是腎小管間質(zhì)纖維化的重用病理生理機制之一。MIF是免疫和炎癥反應中的關(guān)鍵成分[2]，是一種含有115個氨基酸的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量約為12.5 kD[7]。MIF的活化狀態(tài)是由含2個反向平行α螺旋和6個β片層的三個單體組成的同源三聚體，形成一末端開放的中空結(jié)構(gòu)。MIF主要由巨噬細胞產(chǎn)生，其他細胞如淋巴細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、上皮細胞、成纖維細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、生殖組織、脂肪細胞和激素分泌細胞也可表達MIF[8]。MIF主要通過抑制巨噬細胞游走移動，促進巨噬細胞在炎癥局部的聚集、增生及分泌多種細胞因子如白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等發(fā)揮其增強炎癥反應程度的生物學效應。在正常人、大鼠的腎組織中，MIF主要在腎小球臟層和壁層上皮細胞表達，在腎小管上皮細胞弱表達[9]。在人類各種原發(fā)和繼發(fā)腎小球疾病中，腎臟MIF表達均增加[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型中給予MIF拮抗劑處理可改善腎臟的功能及組織學指標[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，UUO大鼠腎小管間質(zhì)ED-1陽性細胞明顯升高，MIF的表達明顯增加，結(jié)果提示MIF可能參與UUO大鼠腎小管間質(zhì)的炎癥反應，與既往在進展性腎炎模型大鼠上的相關(guān)研究一致[11]。

NF-κB屬于NF-κB/Rel家族，由NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、RelA（p65）、RelB及c-Rel五個成員組成，是調(diào)控諸多基因的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥反應、免疫應答、細胞增生及轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的生理病理過程[12-13]。許多與腎臟損傷相關(guān)的刺激（如高糖、蛋白尿、糖基化終產(chǎn)物等）均可引起NF-κB的活化[14-15]，其中起主要作用的是NF-κB1/P65異源二聚體。有研究發(fā)現(xiàn)，MIF可以通過作用于一種轉(zhuǎn)錄因子ETS家族成員PU1來上調(diào)TCL-R4的表達，引起NF-κB過度激活，導致炎癥反應的級聯(lián)放大效應[16-17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，MIF在IgA大鼠腎損傷中的作用機制可能與活化NF-κB/P65有關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠腎小管間質(zhì)中NF-κB/P65核陽性細胞極少，而在UUO大鼠腎小管間質(zhì)的NF-κB/P65核陽性細胞明顯增加，結(jié)果提示在UUO大鼠中，MIF可能通過誘導NF-κB/P65活化，參與腎小管間質(zhì)炎癥反應。

研究發(fā)現(xiàn)，1，25-（OH）2-D3通過減輕梗阻性腎病模型中腎小球硬化的損傷而發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用[19]，已被證實可以延緩腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化的進展[20]，但具體機制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，在UUO大鼠腎臟，MIF表達明顯升高（P<0.01），且ED-1、NF-κB/P65核陽性細胞增加；應用1，25-（OH）2-D3處理降低了MIF在UUO模型大鼠腎臟中的表達和聚集，減少了NF-κB/P65、ED-1核陽性細胞數(shù)量，明顯減輕了腎小管間質(zhì)病變，改善了腎功能。

本研究結(jié)果證實，應用1，25-（OH）2-D3干預可減輕UUO大鼠腎小管間質(zhì)的炎癥反應，緩解腎小管間質(zhì)纖維化。1，25-（OH）2-D3可能通過抑制MIF在腎小管間質(zhì)的表達，減少NF-κB/P65的活化，改善炎癥反應，減輕腎臟損傷。

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（收稿日期：2014-08-01 本文編輯：李亞聰）

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（收稿日期：2014-08-01 本文編輯：李亞聰）

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（收稿日期：2014-08-01 本文編輯：李亞聰）