高效液相色譜法檢測新西蘭Manuka蜂蜜中的甲基乙二醛

陳 磊，欒 軍，費曉慶，吳 斌，沈崇鈺，張 睿

（江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210001）

Manuka蜂蜜是新西蘭特有的一種珍貴蜜種，是蜜蜂采集新西蘭特有的一種紅茶樹——Manuka(Leptospermum scoparium)的花蜜釀造而成的。它區(qū)別于其他蜂蜜之處在于Manuka蜂蜜有強大而獨特的抗菌活性。蜂蜜一般都具有抗菌活性，這是由蜂蜜本身的高滲透性、較強的酸度并且一般含有過氧化物造成的［1，2］。而 Manuka蜂蜜的抗菌活性則不依賴于過氧化物，因此被稱為非過氧化抗菌活性(non-peroxide antibacterial activity，NPA)。1991年，Molan等［3］最早報道了這種抗菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，并將其命名為Manuka獨有因子(unique Manuka factor，UMF)；由于并不清楚UMF的準確分子結(jié)構(gòu)，采用微生物學(xué)方法對Manuka蜂蜜的NPA進行了檢測。通過比較Manuka蜂蜜和一系列不同濃度的苯酚溶液對金黃色葡萄球菌的抑制程度，從而對Manuka蜂蜜的NPA進行評級，并標(biāo)示為UMF5+、UMF10+、UMF15+等等(數(shù)字表示苯酚溶液的濃度)。目前，UMF已經(jīng)被新西蘭UMF蜂蜜協(xié)會(U-nique Manuka Factor Honey Association，UMFHA)作為評價Manuka蜂蜜的質(zhì)量指標(biāo)，并要求被授權(quán)的蜂蜜生產(chǎn)商將其標(biāo)注在產(chǎn)品包裝上。

2008 年，Mavric等［4］發(fā)現(xiàn)甲基乙二醛(methylglyoxal，MGO)可能是Manuka蜂蜜具有NPA的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。同年，Adams等［5］也報道了相同的結(jié)論，并且發(fā)現(xiàn)Manuka蜂蜜中MGO的含量與NPA的相關(guān)性高達0.98。由于采用微生物方法檢測NPA操作比較繁瑣，結(jié)果變異較大，而且物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，因此部分研究人員呼吁采用MGO的含量來代替UMF值用于標(biāo)示Manuka蜂蜜的NPA。但是，也有部分研究人員認為還沒有充分的證據(jù)證明MGO能完全代表Manuka蜂蜜的NPA，而且UMF更能體現(xiàn)新西蘭Manuka植物的地域獨特性和綠色環(huán)保理念。因此，目前市場上銷售的Manuka蜂蜜的產(chǎn)品包裝上會有UMF和MGO兩種指標(biāo)來標(biāo)示Manuka蜂蜜的抗菌活性。

目前國內(nèi)對Manuka蜂蜜的研究較少，且主要集中在其抗菌活性方面。朱威等［1］和玄紅專等［2］綜述了國外對Manuka蜂蜜抗菌活性的研究。孫艷萍等［6］研究了 Manuka UMF25+、UMF10+ 以及其他7種蜂蜜對銅綠假單胞菌的體外抗菌活性，結(jié)論為9種蜂蜜在體外均可抑制銅綠假單胞菌，進口蜜更佳。對Manuka蜂蜜中相關(guān)物質(zhì)的檢測方法，僅見呂辰等［7］采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對多種蜂蜜中的5種雙稠吡咯啶類生物堿進行了篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野百合堿、克氏千里光寧和倒千里光堿均未檢出，而千里光菲啉和千里光寧在大多數(shù)蜂蜜中均能檢出。

MGO屬于二羰基化合物，國內(nèi)報道的檢測方法集中在大氣環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域。李陽等［8］建立了一種五氟化苯肼衍生化-熱解吸-GC/MS方法對大氣中23種羰基化合物進行了測定。牟翠翠等［9］和馮艷麗等［10］分別報道了2，4-二硝基苯肼衍生-高效液相色譜法用于測定大氣中二羰基化合物。鄒婷等［11］采用五氟芐基羥胺衍生與GC/MS聯(lián)用的方法分析了大氣中的單羰基化合物和多羰基化合物。對于蜂蜜中MGO的檢測方法，目前國內(nèi)尚無相關(guān)文獻報道。對此，本實驗室開發(fā)了高效液相色譜法對Manuka蜂蜜的MGO含量進行檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200液相色譜儀，配有自動脫氣機、二元高壓泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器及ChemStation數(shù)據(jù)處理軟件(美國Agilent公司)；PURELAB Option-Q15純水儀(英國ELGA公司)；電子天平(精確到0.00001 g，德國Sartorius公司；精確到0.01 g，瑞士METTLER TOLEDO公司)。

MGO對照品(40%水溶液)購自美國Sigma-Aldrich公司；鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)購自阿拉丁化學(xué)試劑(上海)有限公司；甲醇(色譜純，德國 Merck公司)；水為超純水(18.2 MΩ·cm)；0.22 μm 有機濾膜(德國 Membrana公司)。

Manuka蜂蜜樣品由新西蘭UMF蜂蜜協(xié)會提供，中國蜂蜜樣品由通標(biāo)標(biāo)準技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

1.2 標(biāo)準溶液的配制

精密量取MGO對照品100 μL，用水稀釋并定容至10 mL，配成4 g/L的標(biāo)準儲備液(4℃避光保存)。臨用前用水將標(biāo)準儲備液逐級稀釋為適當(dāng)濃度的標(biāo)準工作溶液。

精密稱取鄰苯二胺0.6 g，用水溶解并定容至100 mL，配成6 g/L的鄰苯二胺水溶液。

1.3 樣品前處理

稱取1 g蜂蜜溶于10 mL水中，取1 mL該蜂蜜水溶液與1 mL鄰苯二胺水溶液(6 g/L)混勻，在室溫、避光條件下進行衍生化反應(yīng)8 h以上，過0.22 μm濾膜后進樣分析。

1.4 液相色譜條件

色譜柱:Kromasil反相色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相:0.1%(v/v)乙酸水溶液(A)和甲醇(B)；檢測波長:318 nm；流速:1.0 mL/min；柱溫:30℃；進樣量:10 μL；保留時間:10.3 min。梯度洗脫程序:0～5 min，30%B；5～10 min，30%B～90%B；10～15 min，90%B；15～16 min，90%B～30%B；16～20 min，30%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化反應(yīng)條件的優(yōu)化

MGO的紫外吸收弱，需衍生化反應(yīng)后再進行檢測。MGO 屬于 1，2-二羰基化合物，Weigel等［12］報道1，2-二羰基化合物能與鄰苯二胺反應(yīng)生成喹噁啉類化合物(見圖1)，在反相色譜柱上有較好的保留，且紫外吸收強。Mavric等［4］和 Oelschlaegel等［13］建立的MGO檢測方法中的衍生化條件均是在Weigel等［12］報道的基礎(chǔ)上進行了修改，均為蜂蜜水溶液與鄰苯二胺水溶液在室溫、避光條件下反應(yīng)8 h以上，只是蜂蜜樣品和鄰苯二胺溶液的濃度不同。本實驗在室溫、避光、反應(yīng)時間(8 h以上)等衍生化條件不變的基礎(chǔ)上，對衍生化試劑的濃度進行了優(yōu)化。

圖1 (a)鄰苯二胺、(b)MGO和(c)MGO衍生化產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of(a)OPD，(b)MGO and(c)MGO derivative

將100 mg/L的MGO標(biāo)準溶液分別與1、2、4、6、8、10 g/L的鄰苯二胺水溶液按體積比1∶1混合，進行衍生化反應(yīng)。通過比較MGO衍生化產(chǎn)物的峰面積考察衍生化效率，結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，鄰苯二胺水溶液的濃度從1 g/L升高到6 g/L，衍生化產(chǎn)物的量逐漸上升；從6 g/L升高到10 g/L，衍生化產(chǎn)物的量開始趨于穩(wěn)定，提示反應(yīng)到達完全。因此，本實驗選擇6 g/L的鄰苯二胺水溶液。

此外，由于蜂蜜直接稀釋后的水溶液含糖量高，對色譜柱傷害較大，本實驗對衍生化反應(yīng)中蜂蜜水溶液的濃度也進行了調(diào)整。Mavric等［4］和 Weigel等［12］報道的方法中蜂蜜水溶液的濃度分別為150和300 g/L，本實驗中蜂蜜水溶液的濃度為100 g/L。并且與鄰苯二胺溶液等體積混合，因此用于進樣的溶液中只含有50 g/L的蜂蜜，能盡量避免高糖基質(zhì)對色譜柱的損傷。在本實驗的方法學(xué)驗證和實際樣品檢測完成前后，色譜柱壓力和MGO衍生化產(chǎn)物的保留時間均未見明顯改變。

圖2 鄰苯二胺濃度對衍生化效率的影響Fig.2 Effect of the mass concentration of OPD on the efficiency of derivatization

2.2 檢測波長的選擇

文獻報道的 MGO 檢測波長為 312 nm［4，12］或316 nm［13］。本實驗中，通過光譜掃描發(fā)現(xiàn)，最佳的檢測波長為318 nm。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

MGO標(biāo)準溶液與鄰苯二胺水溶液進行衍生化反應(yīng)后進行檢測，以衍生化產(chǎn)物的峰面積Y對MGO的質(zhì)量濃度X(mg/L)進行線性回歸，在1～50 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9999。檢出限(S/N=3)為 0.02 mg/L，定量限(S/N=10)為 0.06 mg/L。HPLC圖譜見圖3，在MGO衍生化產(chǎn)物的保留時間附近并沒有干擾峰存在。

圖3 試劑空白(水)及MGO標(biāo)準溶液(1 mg/L)和Manuka蜂蜜樣品的衍生產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of reagent blank(water)and the derivatives of MGO standard solution(1 mg/L)and Manuka honey

Mavric 等［4］、Weigel等［12］和 Oelschlaegel等［13］報道的MGO檢出限分別為0.2、0.2、5 mg/kg，本方法的檢出限為0.02 mg/L，即0.4 mg/kg；差異的原因可能是所使用的蜂蜜水溶液濃度不同。Mavric等［4］和 Weigel等［12］報道的檢出限較低，但蜂蜜水溶液濃度較高(150和30 g/L)，高糖分對色譜柱損傷較大；Oelschlaegel等［13］使用的蜂蜜水溶液濃度很低(15 g/L)，但檢出限太高。本實驗條件中蜂蜜水溶液濃度介于兩者之間，在保證靈敏度的前提下，能盡量減少高糖基質(zhì)對色譜柱的損傷。而且，Manuka蜂蜜樣品中MGO的含量一般較高，本實驗的檢出限能夠滿足實際樣品的檢測需要。

2.4 精密度和回收率

在Manuka蜂蜜樣品中分別添加50.0、100.0、200.0 mg/kg的 MGO，每個添加水平重復(fù) 5次，HPLC檢測后計算精密度和回收率。3個添加水平下的RSD分別為1.26%、0.89%和0.69%，平均回收率分別為98.3%、101.5%和99.5%(見表1)。結(jié)果表明，蜂蜜中的其他物質(zhì)對MGO衍生化產(chǎn)物的檢測準確度并沒有影響。

表1 Manuka蜂蜜中MGO的精密度和回收率(n=5)Table 1 Precision and recovery of MGO spiked in Manuka honey(n=5)

2.5 衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性

在 Manuka蜂蜜樣品中分別添加50、100、200 mg/kg的MGO，每個添加水平重復(fù)3次，在衍生化反應(yīng)結(jié)束后0 h和24 h分別檢測，考察衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖4所示，衍生化產(chǎn)物在室溫放置24 h后仍穩(wěn)定，蜂蜜中的其他物質(zhì)對MGO衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性沒有影響。

圖4 MGO衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性(n=3)Fig.4 Stability of MGO derivative(n=3)

2.6 蜂蜜樣品的檢測

利用本方法對61個Manuka蜂蜜樣品中的MGO含量進行了檢測。其中，UMF標(biāo)示值為5+的蜂蜜樣品共14個，MGO含量為(188.0±62.1)mg/kg；UMF標(biāo)示值為10+的蜂蜜樣品共16個，MGO含量為(324.6±90.4)mg/kg；UMF標(biāo)示值為15+的蜂蜜樣品共12個，MGO含量為(523.7±59.1)mg/kg；UMF標(biāo)示值為20+的蜂蜜樣品共13個，MGO含量為(726.1±76.9)mg/kg；UMF標(biāo)示值為 25+的蜂蜜樣品共 6個，MGO含量為(1035.0±75.8)mg/kg。該檢測結(jié)果與 Adams等［5］和 Stephens等［14］的報道基本相符。

此外，利用本方法對中國不同產(chǎn)地的油菜蜜、荊條蜜、洋槐蜜、椴樹蜜、葵花蜜、棗花蜜、蕎麥蜜、棉花蜜共16個樣品中的MGO含量進行了檢測。結(jié)果顯示，MGO 含量均≤1 mg/kg。Stephens等［14］報道，新西蘭Kanuka蜜、三葉草蜜、Rewarewa蜜和甘露蜜中MGO的含量均遠低于 Manuka蜜。Arena等［15］報道，意大利刺槐蜜、栗子蜜、柑橘蜜、桉樹蜜、甘露蜜以及多花種混合蜂蜜中MGO的含量均≤3 mg/kg。以上研究結(jié)果均顯示，MGO為Manuka蜂蜜中的特有成分。本文建立的MGO含量檢測方法，可以為我國進口Manuka蜂蜜的質(zhì)量評價提供參考。

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜法用于檢測新西蘭Manuka蜂蜜中的甲基乙二醛。該方法前處理簡單，具有良好的靈敏度、回收率和重復(fù)性，可用于新西蘭進口蜂蜜的質(zhì)量控制，也適用于中國蜂蜜中甲基乙二醛的檢測。

［1］Zhu W，Hu F L，Li Y H，et al.Natural Product Research and Development(朱威，胡福良，李英華，等.天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2004，16(4):372

［2］Xuan H Z，Hu F L.Journal of Bee(玄紅專，胡福良.蜜蜂雜志)，2002(9):23

［3］Allen K L，Molan P C，Reid G M.J Pharm Pharmacol，1991，43(12):817

［4］Mavric E，Wittmann S，Barth G，et al.Mol Nutr Food Res，2008，52(4):483

［5］Adams C J，Boult C H，Deadman B J，et al.Carbohydr Res，2008，343(4):651

［6］Sun Y P，Li P.Occupation and Health(孫艷萍，李萍.職業(yè)與健康)，2012，28(19):2366

［7］Lü C，Ding T，Ma X，et al.Chinese Journal of Chromatography(呂辰，丁濤，馬昕，等.色譜)，2013，31(11):1046

［8］Li Y，Shao M，Lu S H.Environmental Chemistry(李陽，邵敏，陸思華.環(huán)境化學(xué))，2009，28(5):630

［9］Mu C C，F(xiàn)eng Y L，Zhai J Q，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(牟翠翠，馮艷麗，翟金清，等.分析化學(xué))，2010，38(11):1573

［10］Feng Y L，Mu C C，F(xiàn)u Z R，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(馮艷麗，牟翠翠，付正茹，等.分析化學(xué))，2011，39(11):1653

［11］Zou T，F(xiàn)eng Y L，F(xiàn)u Z R，et al.Acta Scientiae Circumstantiae(鄒婷，馮艷麗，付正茹，等.環(huán)境科學(xué)學(xué)報)，2012，32(11):2718

［12］Weigel K，Opitz T，Henle T.Eur Food Res Technol，2004，218(2):147

［13］Oelschlaegel S，Gruner M，Wang P N，et al.J Agric Food Chem，2012，60(29):7229

［14］Stephens J M，Schlothauer R C，Morris B D，et al.Food Chem，2010，120(1):78

［15］Arena E，Ballistreri G，Tomaselli F，et al.J Food Sci，2011，76(8):C1203