微波灰化-液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測定干食用菌中的三價鉻和六價鉻

倪張林，湯富彬，屈明華，莫潤宏

（中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，國家林業(yè)局經(jīng)濟林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心(杭州)，浙江 富陽 311400）

鉻(Cr)在自然界中主要以三價鉻(Cr(Ⅲ))和 六價鉻(Cr(Ⅵ))這兩種形態(tài)存在。Cr(Ⅲ)可激活胰島素，參與機體糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝，能增強膽固醇的分解和排泄，防止動脈硬化，促進氨基酸的轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)的合成，促進人體的生長發(fā)育，但較高劑量的Cr(Ⅲ)仍表現(xiàn)出細胞毒性反應(yīng)，長期的累積毒性還有待于進一步的研究［1］；Cr(Ⅵ)可以以和Cr2的形態(tài)通過帶負電荷的細胞膜，并且促使氧化，從而導(dǎo)致病變發(fā)生，具有致癌和誘發(fā)基因突變的作用。

植物體對鉻的富集能力較弱，我們?nèi)粘Ｊ秤玫氖卟怂?，其總鉻含量一般在0.05 mg/kg以下［2］，即使是種植在鉻污染地區(qū)的植物鉻含量也處在較低水平［3］。分析近幾年的文獻報道［4，5］，我們發(fā)現(xiàn):食用菌中鉻含量處在較高水平［5］，但是針對食用菌中鉻形態(tài)的研究卻未見報道。因此，為了對食用菌中鉻的營養(yǎng)與安全做出正確的評價，分別測定其中的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)十分有必要。

目前國內(nèi)外測定鉻形態(tài)的分析方法主要有原子吸收光譜法［6-8］、分光光度 法［9，10］、離子色譜法(IC)［11］、離子色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法(IC-ICP-MS)［12］和高效液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-ICP-MS)［13-17］等。這些方法在測定水質(zhì)、尿樣和牛奶等液體樣品中已有一些應(yīng)用，尤其是HPLC-ICP-MS方法，其采用乙二胺四乙酸(EDTA)與Cr(Ⅲ)配合形成穩(wěn)定的Cr(Ⅲ)-EDTA，使Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)能夠在不同類型的色譜柱上實現(xiàn)分離，并且可保證Cr(Ⅲ)在堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性［13］；但是針對生物質(zhì)固體樣品，采用傳統(tǒng)的前處理方法如浸提、攪拌和超聲提取等方法進行樣品前處理，提取效率低，同時在提取過程中，鉻形態(tài)的穩(wěn)定性得不到保證。本實驗以日常食用量較大的干食用菌為例，采用微波灰化技術(shù)，通過高溫消除食用菌樣品中的有機物，在這個過程中同時能保證樣品中原有的鉻形態(tài)不發(fā)生變化，灰化后的樣品用EDTA溶液配合形成Cr(Ⅲ)-EDTA穩(wěn)定其中的 Cr(Ⅲ)，通過優(yōu)化后的HPLC-ICP-MS方法測定其中的Cr(Ⅲ)和 Cr(Ⅵ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Flexar Binary液相泵(美國PerkinElmer公司)；NexIon 300D ICP-MS(美國 PerkinElmer公司)；PHOENIX微波灰化系統(tǒng)(美國CEM公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國MILLIPORE公司)。50 mL石英坩堝以及其他器皿用酸(30%硝酸)浸泡24 h后，用超純水沖洗晾干備用。

硝酸，優(yōu)級純，德國Merck公司；氨水，優(yōu)級純，德國CNW公司；EDTA二鈉鹽，分析純，廣東西隴化工有限公司；Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)形態(tài)標準溶液，1000 mg/L，美國 Sigma-Aldrich公司；質(zhì)譜調(diào)諧液，PerkinElmer公司。

1.2 樣品前處理

干食用菌樣品采用旋風磨粉碎，過40目篩，稱取過篩樣品0.2 g(精確至0.0001 g)于石英燒杯中，放入微波灰化爐中，設(shè)定程序為:10 min升至300℃，保持30 min，10 min升至600℃，保持2 h；運行完畢冷卻后取出樣品，用10 mL 1%硝酸少量多次將樣品洗入50 mL離心管中，再用0.5 mmol/L EDTA二鈉溶液反復(fù)洗滌至離心管中，用氨水(1∶1，v/v)調(diào)節(jié)pH值為6，定容至50 mL；將定容好的樣品放置在60℃的水浴中靜置60 min，使EDTA與Cr(Ⅲ)充分配合，取出冷卻后上機備用，同時做樣品空白和加標回收試驗。

1.3 標準溶液的配制

用0.5 mmol/L EDTA二鈉(pH 6)稀釋Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)標準溶液至1 mg/L，然后置于水浴中于60℃下保持60 min，取出冷卻后作為標準儲備液。標準使用液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

Hamilton PRP-X100陰離子交換柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)，流動相為 60 mmol/L 硝酸(pH 9.3，氨水調(diào)節(jié))，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。

1.4.2 ICP-MS 條件

射頻(RF)功率:1500 W；等離子氣(Ar)流速:13 L/min；反應(yīng)氣(O2)流速:0.4 mL/min；Rpq(Rejection parameter q)值:0.55；霧化氣流速:1.12 L/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 灰化條件的選擇

傳統(tǒng)的馬弗爐灰化方法是在樣品進入馬弗爐之前需要對其進行炭化，操作繁瑣并且增加樣品被污染的可能性。微波灰化可省去炭化過程，并且爐溫冷卻迅速，節(jié)省了樣品前處理時間，因此本實驗采用微波灰化對食用菌樣品進行前處理；另外，較大的稱樣量會延長灰化時間，同時也會增加樣品溶液中鹽分含量，對色譜柱產(chǎn)生不利；綜合考慮，選擇稱樣量為0.2 g進行灰化實驗。

Cr屬于高溫元素，為了在較短的灰化時間內(nèi)得到較好的灰化效果，考察了400℃至900℃下的灰化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低于600℃條件下不能將樣品較好地灰化，灰分中有較多的黑色炭顆粒；當溫度在600～900℃時，灰化后的樣品都呈白色，灰化效果較好。為了縮短灰化爐的冷卻時間，選擇灰化溫度為600℃。

為了驗證Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)在灰化過程中是否會發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，于空白樣品中分別加入10 μg/L的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)，通過灰化前處理后上機測試其加標回收率，結(jié)果表明:單獨進行Cr(Ⅲ)加標回收試驗時，Cr(Ⅵ)未檢出；單獨進行Cr(Ⅵ)加標回收試驗時，Cr(Ⅲ)也未檢出；Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的加標回收率均達到了85%以上，這說明在灰化過程中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)并未出現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化，這與文獻報道的結(jié)論［8，18］相符合。

2.2 Cr(Ⅲ)-EDTA配合溫度的選擇

用0.5 mmol/L EDTA二鈉溶液(pH 6)配制10 μg/L的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)標準溶液，分別置于40、50、60、70、80 和90 ℃的水浴中 90 min，考察不同溫度下標準溶液中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，Cr(Ⅵ)的響應(yīng)信號無明顯變化，而Cr(Ⅲ)在大于80℃時響應(yīng)信號下降明顯(見圖1)。綜合考慮選擇60℃作為Cr(Ⅲ)-EDTA的配合溫度。

圖1 配合溫度對Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)穩(wěn)定性的影響Fig.1 Influences of stabilities of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)at different complexation temperatures

2.3 Cr(Ⅲ)-EDTA配合時間的選擇

用0.5 mmol/L EDTA二鈉溶液(pH 6)配制10 μg/L的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)標準溶液，分別置于60℃水浴中10、20、30、60、90 和 120 min，考察不同溫度下標準溶液中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，隨著配合時間的延長，整個過程中Cr(Ⅵ)響應(yīng)信號無明顯變化，而Cr(Ⅲ)在大于60 min時響應(yīng)信號才趨于穩(wěn)定(見圖2)，表明此時Cr(Ⅲ)與EDTA已完全配合，因此選擇60 min作為Cr(Ⅲ)-EDTA的配合時間。

圖2 配合時間對Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)穩(wěn)定性的影響Fig.2 Influences of stabilities of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)at different complexation times

2.4 儀器條件的選擇

2.4.1 色譜柱及流動相的選擇

文獻［13-17］報道C18、C8硅膠柱和陰離子色譜柱均可實現(xiàn)Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的分離，但使用C18、C8硅膠柱分離時流動相中需要加入離子對試劑，對色譜柱損傷較大；而陰離子色譜柱應(yīng)用廣泛，耐受性強，因此本實驗采用陰離子色譜柱分離Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)。

流動相采用60 mmol/L硝酸(pH 9.3)。加大流動相濃度可加快這兩種物質(zhì)的出峰時間，當流動相濃度大于60 mmol/L時導(dǎo)致Cr(Ⅲ)-EDTA和Cr(Ⅵ)的保留時間重疊；另外，過高的pH值也會導(dǎo)致保留時間重疊，過低的pH值易導(dǎo)致Cr(Ⅲ)-EDTA出峰時間延長。

2.4.2 質(zhì)譜干擾的消除

鉻元素在自然條件下有6種同位素，豐度最大的為52Cr(豐度83.8%)，但52Cr受質(zhì)譜干擾嚴重。實驗中發(fā)現(xiàn):采用標準模式(STD)測試，52Cr信號完全被噪聲信號湮沒，為了得到理想的靈敏度，實驗加入NH3作為反應(yīng)氣，在動態(tài)反應(yīng)(DRC)模式下使NH3與干擾物反應(yīng)形成其他質(zhì)量數(shù)的物質(zhì)，從而避免質(zhì)譜干擾。通過儀器優(yōu)化后，當NH3的流量為0.4 mL/min、Rpq值為0.55時，52Cr的響應(yīng)值最大，同時背景干擾最低。圖3為加入NH3后，檢測52Cr得到的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的色譜圖。

2.5 線性關(guān)系

取適量的標準儲備液用流動相配制不同濃度的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)混合標準溶液，在優(yōu)化的條件下進行檢測，確定Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的線性范圍、回歸方程以及相關(guān)系數(shù)(r2)；按信噪比(S/N)為3及S/N=10分別計算其檢出限(LOD)和定量限(LOQ)(見表1)。結(jié)果顯示:在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)，目標物的峰面積(Y)與其質(zhì)量濃度(X，μg/L)的線性關(guān)系良好，r2均達到0.9999以上。

圖3 Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)標準溶液(10 μg/L)的色譜圖Fig.3 Chromatogram of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)standard solution(10 μg/L)

表1 Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、線性范圍、檢出限與定量限Table 1 Regression equations，correlation coefficients(r2)，detection limits(LODs)and quantification limits(LOQs)of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)

2.6 方法的回收率與精密度

選用干香菇(mushroom)和干木耳(agaric)做加標回收試驗。分別在樣品中添加Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)混合標準溶液，添加水平分別為1倍LOQ(0.5 μg/L)、10 倍 LOQ(5 μg/L)和 50 倍 LOQ(25 μg/L)，按優(yōu)化后的方法對樣品進行前處理和測定，計算平均回收率，結(jié)果見表2。由表2可知:Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的平均回收率范圍分別為78.0%～90.7%和78.3%～86.4%，RSD分別為1.5%～3.8%和1.9%～3.5%，可滿足干食用菌中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的檢測需求和安全評價。

2.7 實際樣品測定

隨機從市場上抽取6份干食用菌樣品進行測試，其中5份樣品中Cr(Ⅲ)含量在0.083～0.38 mg/kg之間，均未檢出Cr(Ⅵ)；1份野生牛肝菌(bolete)樣品中Cr(Ⅲ)含量為2.13 mg/kg，Cr(Ⅵ)含量為0.23 mg/kg，其色譜圖見圖4。

圖4 牛肝菌樣品及其添加5 μg/L Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)標準溶液的色譜圖Fig.4 Chromatograms of a bolete sample and the bolete sample spiked with Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)solution at 5 μg/L

表2 干食用菌中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的加標回收率與相對標準偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)spiked in dried edible fungi samples(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了微波灰化-液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(LC-ICP-MS)檢測干食用菌中三價鉻和六價鉻的方法。考察了Cr(Ⅲ)-EDTA配合溫度和配合時間對Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)測定的影響，結(jié)果表明，當配合溫度在60℃、配合時間為60 min時，Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的響應(yīng)信號穩(wěn)定。通過優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件，能夠?qū)崿F(xiàn)Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的較好分離，同時消除其他近質(zhì)量數(shù)的質(zhì)譜干擾。該方法穩(wěn)定、可靠、靈敏，可滿足干食用菌中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的測定。

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