高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法測定飼料中的N-氨基甲酰-L-谷氨酸

唐圣蕓，王遠興，溫平威，辛 貞

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

N-氨基甲酰-L-谷氨酸(N-carbamyl-L-glutamic acid)簡稱NCG，是一種性質穩(wěn)定、安全性高的活性物質［1］。它是 N-乙酰-L-谷氨酸 (N-acetyl-L-glutamid acid，NAG)的化學結構類似物［2］，結構式見圖1。已有關于NCG在食品動物生產(chǎn)和人類健康方面的深入研究［3］，發(fā)現(xiàn)其可廣泛用作仔豬飼料添加劑，以替代或部分替代Arg［4］。Arg是仔豬的必需氨基酸，極易缺乏，在飼料中添加量較大，成本高，且會干擾 Trp、Lys和 His等其他氨基酸的代謝［5］。而NCG可作為Arg的代謝激活劑，促進Arg內(nèi)源合成，從而促進幼齡動物的生長和發(fā)育，其所用劑量低且效果顯著，同時避免了對其他氨基酸的干擾［6］。

作為一種潛在的理想飼料添加劑，目前還沒有建立對飼料中NCG的檢測方法，為符合飼料添加劑安全使用規(guī)范和使用劑量，有必要建立一種檢測方法。根據(jù) NCG 的化學結構，可采用核磁共振［7，8］和高效液相色譜法［9，10］鑒定和檢測含量。由于配合飼料中的成分多且基質復雜，本研究小組［5］前期采用柱前衍生-高效液相色譜法分析NCG時發(fā)現(xiàn)基質干擾大，分離度比較差。另外，由于NCG的紫外吸收弱，直接采用紫外檢測響應度低，靈敏度低［11］。高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜(HPLC-ESI-MS/MS)可克服這些不足［12，13］。因此，本文采用 HPLC-ESIMS/MS對飼料中的NCG含量進行了測定。

圖1 (a)N-氨基甲酰-L-谷氨酸和(b)N-乙酰-L-谷氨酸的結構式Fig.1 Structures of(a)N-carbamyl-L-glutamic acid and(b)N-acetyl-L-glutamic acid

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6430液相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源(ESI)(美國Agilent公司)；渦輪振蕩器(太倉市華利達實驗設備有限公司)；高速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)；超聲提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)；固相萃取儀(廣州智真生物科技公司)等。

NCG標準品(純度98%)購于Sigma公司；分析純甲醇、三氯甲烷、正己烷、25%(v/v)氨水溶液均由國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)；色譜純甲酸、甲醇，純度均大于99.9%，購自 Merck KGaA公司；超純水由Milli-Q超純水儀(Millipore公司)制備。色譜柱Unimicro C18(Unimicro Technologies公司)；混合型強陰離子交換反相固相萃取柱(ProElut PXA，60 mg/3 mL)購自北京迪馬科技有限公司；50 mL聚丙烯塑料離心管(北京科友佳生物技術有限公司)。

稱取NCG標準品5.00 mg于50 mL棕色容量瓶中，用純水溶解并定容，配制成100 mg/L的標準儲備液，于4℃下保存，有效期為1個月。

飼料樣品由南昌大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1 提取

［14，15］對飼料中目標物的提取方法，依據(jù)NCG的理化性質進行改進。準確稱取2 g(精確至0.1 mg)粉碎后的飼料樣品于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入10 mL甲醇，超聲提取15 min(每隔5 min振蕩混勻)，以4000 r/min離心10 min，上清液全部轉移到另一離心管中。用上述方法對殘渣重復提取1次，合并上清液。在合并的上清液中加入400 μL 5%(v/v)的氨水溶液后，準確移取 1 mL，用甲醇定容至50 mL，混勻。準確移取3.0 mL上述溶液，待凈化。

1.2.2 凈化

依次用3 mL甲醇和3 mL水活化固相萃取小柱(ProElut PXA，60 mg/3 mL)，將3.0 mL待凈化上清液轉移至固相萃取柱中，再依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，抽至近干，用5 mL含2%(v/v)甲酸的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供上機測定。

1.3 HPLC-MS/MS 條件

HPLC條件 色譜柱:Unimicro C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相:甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液(5∶95，v/v)；柱溫:20 ℃；流速:0.6 mL/min；進樣量:10 μL。

質譜條件 電離源:電噴霧離子源(ESI)；掃描模式:正離子掃描模式(positive)；檢測方式:多反應檢測(MRM)；毛細管電壓:4.0 kV；離子源溫度:100℃；干燥氣溫度:300℃；干燥氣流量:11 L/min；霧化氣壓力:1.03×105Pa。NCG的檢測離子對、碎裂電壓(fragmentor)、碰撞能量(collision energy)等質譜參數(shù)見表1。

1.4 加標回收試驗

準確稱取2 g(精確至0.1 mg)飼料樣品，添加適量NCG標準溶液，渦旋混勻后靜置10 min，按照1.2節(jié)所述的前處理方法進行提取和凈化后，按照1.3節(jié)所述條件進行HPLC-MS/MS檢測。為使標準溶液和樣品溶液具有相同的基質，使用基質匹配標準曲線定量，根據(jù)添加標準品的峰面積計算回收率。

表1 N-氨基甲酰-L-谷氨酸的質譜檢測參數(shù)Table 1 MS parameters for the determination of N-carbamyl-L-glutamic acid

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

根據(jù)NCG的分子結構特征，在電噴霧正離子模式下對NCG標準溶液進行一級質譜分析(Q1掃描)，其一級質譜圖見圖2；再以m/z 191.0作為母離子，進行二級質譜分析(子離子掃描)，得到碎片離子(子離子)信息。然后對NCG二級質譜的源內(nèi)碎裂電壓、碰撞氣能量等參數(shù)進行了優(yōu)化，使NCG的母離子和特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強度最大且穩(wěn)定時為佳。再按照二級質譜圖提供的碎片離子信息，選擇最優(yōu)離子對進行定性和定量。其優(yōu)化后質譜參數(shù)見表1，二級質譜圖見圖3。

圖2 N-氨基甲酰-L-谷氨酸的一級質譜圖Fig.2 MS spectrum of N-carbamyl-L-glutamic acid

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

進行HPLC-MS/MS分析時，流動相的選擇對色譜分析效果和檢測靈敏度都有很大的影響。分別選用甲醇水溶液和乙腈水溶液作為流動相，對比后發(fā)現(xiàn)以甲醇水溶液為流動相時分析物的峰形更好，所以選擇甲醇水溶液。NCG呈弱酸性，試驗發(fā)現(xiàn)在流動相中加入少量甲酸可以提高其電噴霧離子化效率，從而提高靈敏度，同時峰形更好。最終確定如1.3節(jié)所述的流動相條件，進行等度分析。

圖3 N-氨基甲酰-L-谷氨酸的二級質譜圖Fig.3 MS/MS spectrum of N-carbamyl-L-glutamic acid

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

因NCG易溶于水和甲醇中，實驗對比了水、甲醇水溶液(1∶1，v/v)和甲醇作為提取溶劑的效果。發(fā)現(xiàn)以水和甲醇水溶液作為提取溶劑時，雜質更多，干擾比較大，且回收率較低；而以甲醇作提取劑時，干擾相對較小，回收率最好。這可能是由于飼料中大多數(shù)添加藥物呈水溶性，更易溶于水，而不溶于甲醇中。因此，實驗最終選擇甲醇為提取溶劑。

2.3.2 固相萃取柱的選擇

由于飼料中添加了較多藥物，成分復雜，使得樣品的初提取液中雜質較多，直接測定容易對目標化合物造成干擾。為了提高靈敏度和降低檢出限，對樣品初提取液進一步凈化處理。實驗中比較了液-液萃取法和固相萃取法(SPE)兩種方法，發(fā)現(xiàn)用三氯甲烷和正己烷分別進行液-液萃取時，去除基質效果不明顯，回收率也較低，而且萃取時需消耗大量的有機溶劑，不經(jīng)濟且對環(huán)境造成污染，而SPE法更具有優(yōu)勢。所以本實驗采用SPE法進行純化富集。

分別使用反相硅膠鍵合吸附固相萃取柱(ProE-lut C18，200 mg/3 mL，北京迪馬科技有限公司)、ProElut C18-U柱(200 mg/3 mL，北京迪馬科技有限公司)和PXA柱進行凈化，比較固相萃取的效果。結果發(fā)現(xiàn)，C18柱和C18-U柱對目標化合物的凈化效果好，有一定的吸附能力，但其回收率都比較低，分別為37.6%和48.5%，難以滿足要求；而PXA柱的凈化效果較好，對目標化合物的吸附能力很強，回收率為95.3%。故本實驗最終采用PXA柱凈化。

2.3.3 洗脫條件的選擇

由于PXA易吸附陰離子，而NCG為酸性化合物，在樣品初提取液中加入適量的氨水溶液可使NCG呈陰離子形態(tài)，更易吸附在PXA柱上。用3 mL甲醇活化PXA柱，3 mL 0.1%(v/v)的氨水溶液平衡，上樣后依次用3 mL超純水和3 mL甲醇淋洗，抽干后用5 mL含2%(v/v)甲酸的甲醇溶液洗脫，發(fā)現(xiàn)回收率很低。而改用3 mL的純水進行平衡，發(fā)現(xiàn)回收率很理想。分別選擇了上樣3、4和5 mL作比較，結果發(fā)現(xiàn)上樣3 mL時的回收率最高，為95.3%；而上樣4 mL和5 mL時回收率不理想，分別為78.9%和65.6%?？赡苁怯捎赑XA柱對飼料中的某些藥物的吸附能力也比較強，而其吸附容量有限，造成回收率降低，所以選擇上樣量為3 mL。

2.4 方法的線性范圍、標準曲線及定量限

稱取陰性飼料樣品，按照1.2節(jié)所述方法步驟進行操作，制得樣品提取液。用樣品提取液對標準儲備液進行稀釋，得到含量分別為20、50、100、200、500、1000 μg/L的基質標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

為了消除基質效應的影響，使用以上基質標準溶液，按照優(yōu)化后的色譜和質譜條件進樣測定，外標法定量。以NCG特征碎片離子的質量濃度為橫坐標(X，μg/L)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制出標準曲線。其相應的線性回歸方程為 Y=8.1921 X-7.5459，相關系數(shù)(r2)為0.9999。結果表明 NCG在20～1000 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好。在陰性飼料中添加80 μg/kg的NCG標準品進行測定，信噪比大于10，因此確定方法的定量限為80 μg/kg；以信噪比大于3確定檢出限為24 μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

準確稱取飼料樣品，在80、200、500 mg/kg等3個水平做添加回收試驗，每個添加水平做5個平行樣品。NCG在飼料中的回收率和相對標準偏差(RSD)見表2，3個添加水平的回收率在95.3%和104.0%之間，相對標準偏差在5.8%和7.5%之間，滿足飼料中NCG的定量分析要求。NCG加標水平為80 μg/kg的陰性飼料的多反應監(jiān)測掃描色譜圖見圖4。

表2 不同加標水平下N-氨基甲酰-L-谷氨酸的回收率和RSD(n=5)Table 2 Recoveries and RSDs of N-carbamyl-L-glutamic acid at different spiked levels(n=5)

2.6 方法的應用

運用本文建立的方法，對5份仔豬飼料樣品和5份普通豬飼料樣品中的NCG進行了檢測，最終5份仔豬飼料樣品中均檢出NCG，平均含量為309.5 mg/kg，而普通豬飼料樣品中均未檢出NCG。

圖4 陰性加標(80 μg/kg的N-氨基甲酰-L-谷氨酸)飼料的多反應監(jiān)測色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of a negative feedstuff sample spiked with N-carbamyl-L-glutamic acid at 80 μg/kg

3 結論

本文根據(jù)飼料樣品和NCG的特點，采用甲醇超聲提取，混合型強陰離子交換反相固相萃取柱凈化，利用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法在MRM模式下進行定量分析，成功建立了飼料中NCG含量的檢測方法。該方法操作簡單，所需溶劑少，樣品前處理方便迅速、可操作性高，檢測速度快，其靈敏度、準確度和精密度均較高，滿足飼料中NCG的分析檢測要求，完全達到了預期目標，可為日后建立飼料中NCG含量測定的國家標準提供參考。

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