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    糖基化終末產(chǎn)物和磷酸化肌球蛋白輕鏈在糖尿病結(jié)腸動(dòng)力障礙中的作用*

    2014-10-22 12:10:52孫曉萌鞏堯瑤
    胃腸病學(xué) 2014年6期
    關(guān)鍵詞:印跡平滑肌磷酸化

    朱 瀅 孫曉萌 王 云 鞏堯瑤 林 琳

    南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科(210029)

    結(jié)腸動(dòng)力障礙是糖尿病(diabetes mellitus,DM)常見慢性并發(fā)癥之一,約75%的DM患者伴有胃腸動(dòng)力障礙[1-2]。近年發(fā)現(xiàn),糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)在DM患者體內(nèi)顯著升高[3]。目前對AGEs在DM并發(fā)癥中作用的研究主要集中于DM腎病和心血管病,而對DM胃腸動(dòng)力障礙方面的研究較少[4-5]。平滑肌是維持胃腸道運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ),磷酸化肌球蛋白輕鏈(phosphorylated myosin light chain,p-MLC)是平滑肌收縮的重要因素[6-7]。研究[8]發(fā)現(xiàn),MLC 信號通路異常在DM血管病變中發(fā)揮重要作用,但對DM胃腸動(dòng)力障礙的作用尚未明確。本文通過探討DM大鼠結(jié)腸組織中MLC磷酸化與結(jié)腸動(dòng)力的關(guān)系,以及AGEs對MLC磷酸化的影響,旨在為闡明DM腸道動(dòng)力障礙提供依據(jù)。

    材料與方法

    一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

    清潔級Sprague-Dawley雄性大鼠16只,5周齡,體質(zhì)量約150 g,由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。鏈脲菌素、生物素-卵血清-HRP復(fù)合物、乙酰膽堿購自美國Sigma公司;p-MLC兔抗鼠多克隆抗體、總肌球蛋白輕鏈(t-MLC)兔抗鼠多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司;AGEs購自美國Merck Millipore公司。

    二、實(shí)驗(yàn)方法

    1.DM動(dòng)物模型建立:16只大鼠隨機(jī)分為DM組和正常對照組,每組各8只,DM組參照 Wang等[9]的研究給予單次腹腔注射鏈脲菌素60 mg/kg建立DM大鼠模型,正常對照組單次腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液。一周后檢測大鼠尾靜脈血糖水平,血糖>16.7 mmol/L提示造模成功。

    2.結(jié)腸組織標(biāo)本采集:參考Wang等[9]的研究于造模8周后以頸椎脫臼法處死DM組和正常對照組大鼠,取大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織于4%多聚甲醛固定或-80℃冰箱保存待測。

    3.離體結(jié)腸肌條肌張力檢測:取大鼠結(jié)腸組織剝除黏膜層,沿環(huán)形肌方向制備成0.2 cm×1 cm肌條,置于 Tyrode緩沖液浴槽(37 ℃、95%O2、5%CO2),肌條一端固定,一端連接傳感器,給予1 g前負(fù)荷,平衡1 h,加入1 ×10-3mol/L 乙酰膽堿10 μL,待肌條節(jié)律收縮后,記錄肌條肌張力變化。

    4.免疫組化染色檢測結(jié)腸組織p-MLC表達(dá):取結(jié)腸組織石蠟切片,常規(guī)脫蠟、水化,抗原熱修復(fù),內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育;滴加p-MLC抗體(1∶150),4℃孵育48 h;滴加生物素標(biāo)記的二抗(1∶500),室溫孵育 3 h,滴加生物素-卵血清-HRP復(fù)合物(1∶500),室溫孵育3 h;DAB顯色,蘇木精復(fù)染,中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照,以已知陽性切片作為陽性對照。

    5.蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)腸組織p-MLC、t-MLC表達(dá):提取結(jié)腸組織總蛋白,裂解液冰裂解30 min,以BCA法測定蛋白濃度,取50 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉1 h,分別加入p-MLC 抗體(1∶500)、t-MLC 抗體(1∶1000),4 ℃孵育過夜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,37℃孵育1 h,ECL顯影,凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析。MLC磷酸化水平以p-MLC/t-MLC/β-actin表示。

    6.結(jié)腸平滑肌細(xì)胞(SMCs)分離培養(yǎng):正常對照組大鼠處死后,距肛門端2 cm處取結(jié)腸組織10 cm,以Hepes-Ringer緩沖液反復(fù)沖洗,去除黏膜層和漿膜層,剪碎平滑肌組織,加入消化液,1500 r/min離心5 min,以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞、過篩,接種于培養(yǎng)皿于37℃、95%O2、5%CO2條件下培養(yǎng),待SMCs長至致密單層時(shí),以PBS沖洗,加入無血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h。

    7.蛋白質(zhì)印跡法檢測 SMCs的 p-MLC、t-MLC表達(dá):取SMCs分為AGEs不同濃度處理組和不同時(shí)間處理組,前者分別以 AGEs 0、10、50、100 μg/mL干預(yù)SMCs 30 min,后者分別以 AGEs 50 μg/mL干預(yù) SMCs 0、15、30、60 min,以蛋白質(zhì)印跡法檢測SMCs的p-MLC、t-MLC表達(dá),實(shí)驗(yàn)方法同步驟5。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、DM模型驗(yàn)證

    DM組大鼠血糖均>16.7 mmol/L,提示造模成功。DM組血糖水平較正常對照組顯著升高[(28.12 ±2.33)mmol/L 對(6.92 ± 1.31)mmol/L,P <0.01],體質(zhì)量顯著減低[(368.21 ±12.32)g對(512.62 ±15.44)g,P <0.01]。

    二、結(jié)腸肌條肌張力變化

    乙酰膽堿作用后,與正常對照組相比,DM組大鼠結(jié)腸平滑肌張力顯著減弱[(0.89±0.09)g對(1.98 ±0.12)g,P <0.05]。

    三、結(jié)腸組織p-MLC表達(dá)情況

    免疫組化染色結(jié)果顯示,p-MLC陽性染色表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),呈棕色顆粒樣,主要位于黏膜肌層和肌層。DM組大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織p-MLC表達(dá)水平較正常對照組減少,以黏膜肌層、環(huán)肌層減少最為顯著(見圖1)。

    圖1 結(jié)腸組織p-MLC表達(dá)情況(免疫組化染色,×200)

    四、結(jié)腸組織MLC磷酸化水平

    蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示,與正常對照組相比,DM組大鼠結(jié)腸組織p-MLC/t-MLC/β-actin水平顯著降低(0.98 ± 0.10 對 1.61 ± 0.12,P < 0.05)(見圖2)。

    圖2 結(jié)腸組織p-MLC、t-MLC表達(dá)水平(蛋白質(zhì)印跡法)

    五、不同濃度AGEs對SMCs中MLC磷酸化水平的影響

    與 AGEs 0 μg/mL 組相比,AGEs 10、50 μg/mL組p-MLC/t-MLC/β-actin水平顯著降低 (0.63±0.01、0.45 ±0.02 對 1.05 ±0.03,P <0.05),AGEs 100 μg/mL組與 AGEs 0 μg/mL組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)(見圖3)。

    圖3 不同濃度AGEs對SMCs中p-MLC、t-MLC表達(dá)水平的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

    六、不同作用時(shí)間AGEs對SMCs中MLC磷酸化水平的影響

    與 AGEs 0 min組相比,AGEs 30、60 min組p-MLC/t-MLC/β-actin 水平顯著降低(0.26 ±0.04、0.25± 0.02 對 0.92 ± 0.05,P < 0.05)。AGEs 15 min組與AGEs 0 min組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)(見圖4)。

    圖4 不同作用時(shí)間AGEs對SMCs中p-MLC、t-MLC表達(dá)水平的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

    討 論

    DM結(jié)腸動(dòng)力障礙表現(xiàn)為結(jié)腸張力和收縮力降低、蠕動(dòng)減慢、排空延遲[10]。平滑肌是胃腸運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ),平滑肌收縮功能改變與DM結(jié)腸動(dòng)力障礙密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,DM大鼠結(jié)腸平滑肌張力減低,證實(shí)DM大鼠伴有結(jié)腸動(dòng)力障礙。同時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織p-MLC表達(dá)減少,MLC磷酸化水平減低,表明DM大鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙由p-MLC減少所致。進(jìn)一步行離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),AGEs可抑制SMCs發(fā)生MLC磷酸化。上述研究提示DM患者結(jié)腸動(dòng)力障礙與其體內(nèi)AGEs水平升高,抑制SMCs MLC磷酸化,從而減弱結(jié)腸平滑肌張力有關(guān)。

    AGEs是蛋白質(zhì)和脂類經(jīng)非酶糖基化后生成的含多種結(jié)構(gòu)分子的混合物,AGEs可通過受體依賴性和受體非依賴性途徑促進(jìn)DM并發(fā)癥發(fā)生[11],其不僅與蛋白質(zhì)結(jié)合,亦可通過與核酸、脂質(zhì)結(jié)合,參與DM并發(fā)癥形成。此外,AGEs可激活一系列信號通路,促進(jìn)炎性因子、氧化產(chǎn)物生成增加,導(dǎo)致組織器官損傷,在DM并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)AGEs可抑制SMCs的MLC磷酸化,從而影響結(jié)腸平滑肌張力,然而由于尚不明確AGEs的特異性受體拮抗劑,因此未能證明AGEs作用的相關(guān)信號通路。

    MLC磷酸化是決定平滑肌收縮的重要因素,其可縮短肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白間的橫橋周期,引起平滑肌收縮。MLC磷酸化受肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)正向調(diào)節(jié)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)負(fù)向調(diào)節(jié),后者使其去磷酸化,從而導(dǎo)致平滑肌松弛[14-16]。研究[17-18]顯示,DM大鼠幽門、回腸動(dòng)力減弱伴MLCK表達(dá)減少;DM大鼠尾動(dòng)脈收縮功能減弱伴p-MLC表達(dá)減少;DM兔膀胱平滑肌收縮功能減弱伴p-MLC表達(dá)升高,提示p-MLC和MLCK在不同組織中的表達(dá)水平和作用效應(yīng)有所不同,相關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步研究。本研究證實(shí)DM大鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙伴有結(jié)腸組織p-MLC表達(dá)減少,但未進(jìn)一步研究MLCK和MLCP在此過程中的作用,擬在后續(xù)研究中闡明。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),DM大鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙可能由AGEs抑制SMCs中的MLC磷酸化所致。然而,此過程中仍有部分機(jī)制未完全明了,如AGEs降低p-MLC表達(dá)的信號通路,MLCK、MLCP對p-MLC的調(diào)節(jié)效應(yīng)等,有待未來進(jìn)一步研究深入探討。

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