內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白在百草枯致大鼠急性肺損傷中的變化

白雪 盛英杰 蔡雪 王耀 戢新平

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.08.012

基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳高等學(xué)?？蒲谢鹳Y助項(xiàng)目（L2010682）

作者單位：110004 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科

通信作者：戢新平，Email： jxpwh_ok@163.com

百草枯（paraquat，PQ）又名對草快，其20%的溶液稱克無蹤，是一種有機(jī)雜環(huán)類觸殺、滅生型高毒性除草劑。人類誤服百草枯后，無特效解毒劑，中毒病死率極高^[1]，其主要死因早期為急性肺損傷^[2]，后期進(jìn)展為不可逆性肺纖維化^[3]。百草枯中毒的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚^[4]，大量研究顯示細(xì)胞凋亡參與百草枯所致的急性肺損傷^[5]。本研究通過建立百草枯中毒大鼠的急性肺損傷模型，初步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在百草枯誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康SPF級Spragne-Dawley（SD）大鼠80只，雄性（由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供），體質(zhì)量200～250 g。

1.2 主要試劑與儀器

20%百草枯水溶液購于中國先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司（用無菌生理鹽水將1 mL克無蹤稀釋至100 mL混勻，配制成2 mg/mL溶液）；兔抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein，GRP78）、兔抗生長停滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因153（C/EBP homology protein/growth arrest and DNA damage-inducible gene，CHOP/GADD153）多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；GAPDH多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；超敏二步法免疫組化檢測試劑購自中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。顯微鏡型號：日本Nikon E800。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型建立 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)，因染毒組在實(shí)驗(yàn)過程中有死亡，故增加實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量，以保證所觀察的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)動物數(shù)量相同。SD大鼠隨機(jī)（隨機(jī)區(qū)組法）分為對照組（40只）、百草枯染毒組（40只）。①百草枯染毒組（簡稱PQ組）：按20 mg/kg計(jì)算，腹腔注射配制的百草枯溶液；②對照組：給予0.9%的無菌生理鹽水（NS）等量腹腔注射。對照組及染毒組于給藥后8 h、1 d、3 d、5 d各處死10只大鼠。左肺用4%多聚甲醛固定，HE染色及免疫組織化學(xué)測定；右肺迅速-80 ℃冷凍保存，行Western blot蛋白測定。

1.3.2 病理學(xué)檢查 肺組織用4%多聚甲醛溶液固定后，常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.3.3 Western blot法檢測GRP78、CHOP蛋白表達(dá) 取各組大鼠肺組織各100 mg，加入1 mL組織蛋白裂解液后剪碎組織，勻漿機(jī)將組織超聲裂解后，取勻漿液4 ℃15 000 r/min離心20 min。取上清液，BCA法蛋白定量。取50 μg蛋白變性，上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE 凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉1h后，分別加入兔抗大鼠 GRP78 多克隆抗體（1∶ 1 000 稀釋）、兔抗大鼠CHOP多克隆抗體（1∶ 1 000 稀釋）和GAPDH（1∶ 2000稀釋）4 ℃振蕩孵育過夜。TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG（1∶ 2000 稀釋）室溫1 h。TBST洗滌后，利用ECL 超敏發(fā)光液， X 線膠片曝光、顯影。以 GAPDH 為內(nèi)參照。采用分子生物學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量掃描測定條帶灰度值， 將每個(gè)樣本的灰度值與相應(yīng) GAPDH 的灰度值相比， 計(jì)算蛋白的表達(dá)水平。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測GRP78、CHOP蛋白表達(dá) 取石蠟切片（4 μm），常規(guī)脫蠟、水化。滴加3%H2O₂去離子水室溫孵育20 min，檸檬酸鹽緩沖液微波加熱修復(fù)抗原，滴加一抗（兔抗大鼠GRP78、CHOP多克隆抗體，抗體稀釋的工作濃度均為1∶ 200，另外采用PBS代替一抗的方法制備陰性對照）4 ℃過夜。滴加Polymer Helper的二抗37 ℃ 30 min，滴加poly-HRP anti-Rabbit IgG 37 ℃30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。顯微鏡下照相，采用全自動圖像分析系統(tǒng)（NIS-Elements Br3.0）分別計(jì)算其平均光密度，取其均值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示， 采用 SPSS 17.0軟件分析，單因素方差分析法比較多個(gè)樣本均數(shù)、LSD-t檢驗(yàn)法進(jìn)行均數(shù)之間的兩兩比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理特點(diǎn)

（1）大體觀察：對照組大鼠肺臟呈粉紅色，包膜光滑；染毒組8 h大鼠肺組織局部出現(xiàn)輕度充血，染毒1 d、3 d、5 d大鼠肺組織充血逐漸加重，體積逐漸增大，部分肺呈彌漫性出血，染毒5 d大鼠肺組織有大面積出血點(diǎn)及瘀血。

（2）光鏡觀察：正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清楚，肺泡腔內(nèi)無炎性細(xì)胞，肺泡間隔正常，無炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織增生；染毒8 h大鼠肺組織內(nèi)少量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，其中以中性粒細(xì)胞為主，肺組織結(jié)構(gòu)基本正常；染毒1 d大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤有所增加，部分肺泡間隔斷裂，肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞、水腫液聚集，肺組織結(jié)構(gòu)仍處于正常狀態(tài)。染毒3 d大鼠肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺間隔斷裂明顯，局部出現(xiàn)典型肺大泡表現(xiàn)。染毒5 d炎性細(xì)胞浸潤及肺組織結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步增加見圖1。

2.2 大鼠肺組織中GRP78、CHOP蛋白表達(dá)

對照組8 h、1 d、3 d、5 d中GRP78/GAPDH灰度比值為（0.78±0.0339、0.76±0.0491、0.771±0.0533、0.775±0.0313），PQ組8 h、1 d、3 d、5 d中GRP78/GAPDH灰度比值為（1.361±0.2466、0.936±0.138、0.85±0.0889、0.528±0.1123），E組與A組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.92，P<0.05），F(xiàn)組與B組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.4，P<0.05），A、B、C、D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組8 h、1 d、3 d、5 d中CHOP/GAPDH灰度比值為（0.6±0.1153、0.61±0.073、0.65±0.019、0.63±0.0993），PQ組8 h、1 d、3 d、5 d中CHOP/GAPDH灰度比值為（2.335±0.0933、1.824±0.1121、1.158±0.0421、0.632±0.0883）。E組與A組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=31.76，P<0.05），F(xiàn)組與B組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.23，P<0.05），G與C組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.3，P<0.05），A、B、C、D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組GRP78、CHOP蛋白表達(dá)水平基本相同，染毒8 h組GRP78、CHOP蛋白表達(dá)明顯增加，且隨時(shí)間推移，PQ 1 d、3 d、5 d組GRP78、CHOP蛋白表達(dá)逐漸下降。 見圖2。2.3 肺組織中GRP78、CHOP蛋白表達(dá)水平

免疫組化染色顯示，正常大鼠肺組織中僅有少數(shù)細(xì)胞胞漿呈淺黃色，染毒組大鼠肺組織細(xì)胞的陽性表達(dá)呈棕黃色，較對照組染色明顯增強(qiáng)，且染毒8 h組陽性表達(dá)最多，GRP78陽性表達(dá)主要位于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞以及少量的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)。而CHOP陽性表達(dá)主要位于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞的胞核內(nèi)，仍是染毒8 h組陽性表達(dá)最多。對照組及染毒組大鼠肺組織中GRP78、CHOP表達(dá)具體情況見圖3及表1。E組與A組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=62.36、15.69，P<0.05），F(xiàn)組與B組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=54.3、13.47，P<0.05），G與C組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=50.09、9.8，P<0.05），H組與D組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=39.02、5.91，P<0.05），A、B、C、D組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

3 討論

百草枯中毒引起急性肺損傷的機(jī)制十分復(fù)雜，近年來研究發(fā)現(xiàn)，肺組織細(xì)胞凋亡在百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷中扮演著重要角色。目前已知的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)存在3條途徑分別為死亡受體活化途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。

胡軍利和佟飛等^[6-7]研究發(fā)現(xiàn)百草枯中毒大鼠肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子（TNF-α），TNF-α與細(xì)胞膜上 的腫瘤壞死因子受體（TNFR）結(jié)合啟動死亡受體活化途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Dinis-Oliveira等^[8]研究發(fā)現(xiàn)，百草枯導(dǎo)致大鼠肺組織P53、AP-1表達(dá)增加，造成線粒體膜電位下降，線粒體內(nèi)、外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔（permeability transition pore，PTP）大量開放，細(xì)胞凋亡啟動因子從線粒體釋放，激活caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑是否參與百草枯誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷在國內(nèi)外文獻(xiàn)中未見相關(guān)報(bào)道。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指多種生理或病理?xiàng)l件引起未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能。缺氧、饑餓、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏（包括氨基酸、葡萄糖等）、毒性物質(zhì)（如重金屬）、氧自由基、鈣離子平衡失調(diào)、蛋白質(zhì)糖基化與折疊抑制均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激^[9]。

正常狀態(tài)下，分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78/免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（glucose-regulated protein 78/ binding immunoglobulin protein， GRP78/ BIP）與3個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白[包括抑制物阻抗性酯酶1（Inositol-requiring enzyme 1，IRE-1）、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PKR-like ER kinase，PERK）、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）]結(jié)合，處于無活性狀態(tài)^[10]。

當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，GRP78/BIP與3個(gè)跨膜應(yīng)激感受蛋白解離，并與錯(cuò)誤折疊蛋白或未折疊蛋白結(jié)合，同時(shí)解離后的感受蛋白通過各自的信號傳導(dǎo)途徑啟動未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），減少未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)累積，促進(jìn)其降解。因此， ERS標(biāo)志性蛋白GRP78表達(dá)增加一定程度上反映了ERS的啟動^[11]。但過強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過長的ERS可激活下游的凋亡信號分子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enchancer-binding protein-homologous protein，CHOP），又稱生長停滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因153（growth arrest and DNA damage inducible gene 153，GADD153），啟動細(xì)胞凋亡。CHOP/ GADD153 是 ER 應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子，屬于C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，正常情況下存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)量少，但在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況下其表達(dá)上調(diào)并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，調(diào)控靶基因表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞分化等^[12-13]。本實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)^[14]的方法成功建立百草枯大鼠急性肺損傷模型，通過檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性指標(biāo)GRP78和CHOP發(fā)現(xiàn)百草枯染毒8 h、1 d組大鼠肺組織中GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平明顯增加，提示百草枯誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷啟動了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并且誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

百草枯中毒可產(chǎn)生大量活性氧自由基^[4]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對氧化應(yīng)激反應(yīng)敏感，其作為活性氧主要攻擊的目標(biāo)，同時(shí)百草枯造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失衡^[15]，也可能啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期啟動的非折疊蛋白反應(yīng)，實(shí)質(zhì)上屬于一種自我保護(hù)機(jī)制，在早期干預(yù)，可使細(xì)胞恢復(fù)正常生理功能，由此推測若早期通過藥物干預(yù)百草枯造成的肺損傷，能否阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

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（收稿日期：2013-12-22）

（本文編輯：何小軍）

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