內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激在百草枯致大鼠肺纖維化中的作用及沙苑子總黃酮的影響

張志堅(jiān) 周從陽(yáng) 彭禮波 吳燦 田黎 首云峰

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.09.012

基金項(xiàng)目：重慶市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目（2012-2-419）

作者單位：401320 重慶，巴南區(qū)人民醫(yī)院ICU（張志堅(jiān)、彭禮波），骨科（吳燦），感染科（田黎），心內(nèi)科（首云峰）；南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科（周從陽(yáng)）

通信作者：彭禮波，Email：plbbnicu@yeah.net

肺纖維化（pulmonary fibrosis）是由多種致病因素導(dǎo)致肺損傷后出現(xiàn)的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，常常因彌漫性肺泡炎癥、肺成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積引起嚴(yán)重的臨床癥狀^[1-3]。百草枯（paraquat，PQ） 作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的除草劑，自問(wèn)世以來(lái)中毒事件屢有發(fā)生，甚至有越來(lái)越多的趨勢(shì)。肺臟是PQ作用于機(jī)體的最主要的靶器官，肺纖維化是其后期的最常見的致死原因。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)PQ中毒進(jìn)行了積極的研究，但至今尚未發(fā)現(xiàn)確切改善其預(yù)后的藥物及治療方法，因此，尋找有效的減輕肺纖維化的藥物，成為廣大研究者共同關(guān)注的焦點(diǎn)。

沙苑子總黃酮（total flavonoids from astragalus complanatus，F(xiàn)AC）是從中藥沙苑子成熟種子中提取的有效成分。沙苑子具有補(bǔ)益肝腎的功效，其主要成分為黃酮類、三萜類及有機(jī)酸，目前已發(fā)現(xiàn)FAC具有抗纖維化、抗衰老、抗腫瘤等作用^[4-5]。但FAC對(duì)PQ誘導(dǎo)的肺纖維化治療作用鮮有報(bào)道。本文采用PQ灌胃法制作大鼠肺纖維化模型，初步探討FAC對(duì)肺纖維化的干預(yù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

20%百草枯溶液由上海先正達(dá)公司提供；沙苑子總黃酮由蘇州中藥研究所植化室提供； 羥脯氨酸（HYP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）考馬斯亮藍(lán)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。兔抗大鼠多克隆GRP78抗體、免疫組化SABC試劑盒及DAB顯色劑均購(gòu)于武漢博士德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制作

30只清潔級(jí)Spragne-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量（220±40）g，由南昌大學(xué)動(dòng)物科學(xué)部提供。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為正常對(duì)照組（正常組），肺纖維化模型組（模型組）和沙苑子總黃酮治療組（FAC組）。模型組和FAC組參照文獻(xiàn)[6]PQ灌胃法誘導(dǎo)肺纖維化模型。正常組給予等量生理鹽水灌胃。從造模第2天開始，F(xiàn)AC組即給予FAC 70 mg/（kg·d）灌胃治療，而模型組和正常組給予等量生理鹽水灌胃。于造模后第28天股動(dòng)脈放血處死所有大鼠。

1.3 組織標(biāo)本采集及檢測(cè)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肺組織采集 按預(yù)定時(shí)間點(diǎn)稱重后處死動(dòng)物。分離主支氣管并向下剝離后取出全肺，無(wú)菌生理鹽水沖洗，濾紙吸干并稱質(zhì)量，計(jì)算肺系數(shù)（肺系數(shù)=肺濕質(zhì)量/體質(zhì)量）。取右肺中葉4%中性甲醛溶液固定48 h后轉(zhuǎn)移至0.1 mol/L PBS溶液中保存，待行肺組織病理學(xué)形態(tài)及免疫組化檢測(cè)。左肺中葉取下后-80 ℃保存，待測(cè)HYP、SOD及MDA。

1.3.2 肺組織HYP、MDA含量及SOD活性測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 肺組織GRP78蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè) 切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2處理，微波修復(fù)抗原，滴加兔抗大鼠GRP78多克隆抗體（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%），4 ℃過(guò)夜后加生物素化羊抗兔IgG，在37 ℃孵育30 min，加SABC工作液，DAB顯色，蘇木素染色。陰性對(duì)照以PBS緩沖代替一抗。每個(gè)樣本隨機(jī)抽取5個(gè)高倍鏡下觀察，以胞漿黃染的細(xì)胞作為GRP78陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，計(jì)算出陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。陽(yáng)性細(xì)胞百分率=（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.3.4 肺組織病理學(xué)觀察 取右肺下葉，用4%甲醛溶液固定，按病理學(xué)方法脫水、包埋、切片，進(jìn)行HE和Masson染色，光鏡下觀察肺泡炎、肺纖維化程度，參照Szapiel等^[7]的方法觀察肺泡炎程度并分級(jí)計(jì)分，采用Hubner等^[8]的方法觀察肺纖維化程度并進(jìn)行評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物28 d病死率

3組大鼠28 d內(nèi)僅模型組死亡1只；對(duì)照組及FAC組均無(wú)大鼠死亡；病死率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 肺組織形態(tài)學(xué)改變

正常組肉眼見肺組織呈均勻粉紅色，表面較光滑，質(zhì)軟彈性好。模型組肉眼見肺組織表面蒼白，質(zhì)硬，彈性降低，部分可見彌漫性出血灶。FAC組肉眼見肺組織表面凹凸不平，彈性降低，局部可見少量出血點(diǎn)。

光鏡下對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡間隔正常，肺泡腔內(nèi)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組光鏡下見肺間質(zhì)和肺泡水腫，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞大量增生，肺泡腔結(jié)構(gòu)破壞，部分被纖維組織取代呈條索樣分布。FAC組肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡破壞程度較模型組明顯減輕（圖1）。三組大鼠28 d肺組織肺泡炎變及纖維化程度，見表1。

2.3 三組大鼠肺系數(shù)比較

模型組與FAC組肺系數(shù)為（11.89±1.18）vs.（6.29±1.83），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組（4.59±0.49）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.4 三組大鼠肺組織HYP、SOD及MDA含量比較

模型組大鼠肺組織HYP含量明顯高于對(duì)照組和FAC組（P<0.01）。FAC組較模型組肺組織HYP含量明顯下降（P<0.01）。模型組肺組織SOD較對(duì)照組明顯降低，而MDA則明顯升高（P<0.01）；FAC組肺組織SOD含量較模型組明顯升高（P<0.05），但低于對(duì)照組；而MDA含量明顯低于模型組（P<0.01）。見表2。

2.5 三組大鼠肺組織中GRP78蛋白表達(dá)比較

對(duì)照組大鼠肺組織僅有少數(shù)細(xì)胞胞漿黃染；模型組肺組織細(xì)胞中可見大量GRP78陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色，主要位于支氣管上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)。對(duì)照組、模型組與FAC組GRP78陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為（0.15±0.09）%、（0.84±0.15）%和（0.25±0.06）%；三者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。FAC組陽(yáng)性表達(dá)較模型組明顯減少。見圖2。

3 討論

肺纖維化是導(dǎo)致呼吸功能嚴(yán)重受損的纖維化疾病，是臨床上呼吸衰竭常見原因之一，主要以成纖維細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積為主要的病理特征。隨著PQ的廣泛使用，中毒事件日趨增多，因其極高的病死率及臨床救治的困難，一直都是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。肺臟是百草枯中毒的主要靶器官，肺纖維化是PQ中毒后期的主要并發(fā)癥及死亡原因，尋找有效改善PQ后肺纖維化是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。本研究以PQ灌胃復(fù)制肺纖維化動(dòng)物模型比較接近于臨床常見情況。

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪（Astragalus complanatus R.Br）干燥成熟的種子。在近年的研究中發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝、腎、免疫系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)均有一定的藥理效應(yīng)。沙苑子總黃酮為沙苑子的乙醇提取物，其主要有效成分是黃酮，其主要的藥理作用為抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗肝纖維化、誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能及改善血液流變學(xué)^[9-11]。但它對(duì)機(jī)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響尚未見報(bào)道。

羥脯氨酸（HYP）因其在膠原組織中占13.4%，而在彈性蛋白中含量極少，故檢測(cè)肺組織HYP含量是反映膠原沉積情況的可靠指標(biāo)。本研究中筆者檢測(cè)到模型組大鼠肺組織勻漿中HYP較對(duì)照組比較明顯增多；結(jié)合肺組織病理學(xué)觀察表明該實(shí)驗(yàn)肺纖維化模型復(fù)制成功。而FAC干預(yù)后大鼠肺組織中HYP含量明顯減少，結(jié)合病理學(xué)觀察表明FAC能有效減輕PQ導(dǎo)致的肺纖維化程度。

大量基礎(chǔ)研究已經(jīng)表明氧化應(yīng)激是肺纖維化的重要發(fā)病機(jī)制之一，特別在PQ中毒中該機(jī)制更加重要，因此減輕PQ中毒后氧化應(yīng)激、糾正機(jī)體氧化-抗氧化失衡可明顯減輕肺纖維化程度^[12-15]。SOD是機(jī)體內(nèi)最主要的氧自由基清除酶，測(cè)定其活力可反映機(jī)體自由基清除能力；MDA則是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，測(cè)定其含量可反映機(jī)體組織細(xì)胞氧化損傷的程度，對(duì)上述指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)能評(píng)價(jià)組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組肺組織MDA較對(duì)照組明顯升高，而SOD則明顯降低，給予FAC干預(yù)后氧化應(yīng)激指標(biāo)則明顯改善，說(shuō)明FAC能較好地提高機(jī)體抗氧化的能力，在一定程度上能糾正PQ引起的機(jī)體氧化-抗氧化失衡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞重要的Ca2+貯存器，也是蛋白質(zhì)合成與翻譯后修飾、多肽鏈正確折疊與裝配、參與脂質(zhì)代謝和類固醇激素的合成的重要場(chǎng)所。研究發(fā)現(xiàn)，多種因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)破壞。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能通過(guò)減少蛋白質(zhì)翻譯、分子伴侶以及相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，增加未折疊蛋白質(zhì)降解等途徑使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，這些變化統(tǒng)稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stresss）^[16-17]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)78（glucose regulating protein 78，GRP78）是廣泛分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶，其主要功能是協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊、裝配及運(yùn)輸。當(dāng)應(yīng)激因素導(dǎo)致ERS發(fā)生后，GRP78合成顯著增加，因此又稱其為ERS發(fā)生的標(biāo)志性蛋白^[18]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺組織中ERS標(biāo)志性蛋白GRP78表達(dá)顯著增加，而給予FAC干預(yù)后肺組織GRP78表達(dá)明顯下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明PQ誘導(dǎo)肺纖維化過(guò)程中，除了氧化應(yīng)激的參與外，ERS的參與也是重要的一環(huán)。但二者之間有何緊密的聯(lián)系尚需要進(jìn)一步研究才能得出結(jié)論。

參考文獻(xiàn)

[1] Kikuchi N， Ishii Y， Morishima Y，et al. Aggravation of bleomycin-induced pulmonary inflammation and fibrosis in mice lacking peroxiredoxin I[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2011，45（3）：600-609.

[2] Wahers DM， Cho HY， Kleeberger SR. Oxidative stress and antioxidants in the pathogenesis of pulmonary fibrosis： a potential role for Nrf2[J]. Antioxid Redox Signal，2008，10（2）：321-332.

[3] Xu M， Deng B， Chow YL， et al. Effects of curcumin in treatment of experimental pulmonary fibrosis：A comparison with hydrocortisone[J].J Ethnopharmacol，2007，112（2）：292-299.

[4] 劉春宇，顧振綸，韓蓉，等.沙苑子提取物對(duì)小鼠四氯化碳肝損傷的保護(hù)作用[J].中草藥，2002，33（12）： 1104-1106.

[5] 侯燕，馮一中，蔣小崗，等.沙苑子總黃酮對(duì)博萊霉素致大鼠肺纖維化的干預(yù)作用及其機(jī)制研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（1）：88-93.

[6] 張慧利，柳遠(yuǎn)飛，羅序睿，等.氫氣飽和生理鹽水對(duì)百草枯中毒大鼠肺組織的作用[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2011，20（7）：708-711.

[7] Szapiel SV， Elson NA， Fulmer JD， et al. Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude， athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis，1979，120（4）：893-899.

[8] Hubner RH， Gitter W， Mokhtari HE， et al.Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples[J].Biotechniques，2008，44（4）：507-517.

[9] 張熠，韋翠萍，顧振綸，等.沙苑子黃酮對(duì)S180小鼠的抑瘤作用及對(duì)其免疫功能的影響[J].中草藥，2006， 37（8）：1221-1223.

[10]齊琳，劉春宇，吳文倩，等.沙苑子黃酮對(duì)60Coγ射線損傷作用的影響[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008， 28（1）：26-29.

[11] 韋翠萍，王建梅，顧振綸，等.沙苑子黃酮對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制與誘導(dǎo)凋亡作用及其對(duì)NF-κB表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（5）：1167-1169

[12] Dinis-Oliveira RJ， Duarte JA， Sanchez-Navarro A， et al. Paraquat poisonings： mechanisms of lung toxicity，clinical features，and treatment[J].Crit Rev Toxicol，2008，38（1）：13-71.

[13] Li S， Crooks PA， Wei X， et al. Toxicity of dipyridyl compounds and related compounds[J].Crit Rev Toxicol，2004，34（5）：447-460.

[14] 周從陽(yáng)，謝姝，羅雅娟，等.百草枯中毒大鼠肺組織中的4-羥基壬烯醛表達(dá)和烏司他丁的影響[J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2012，30（6）：457-459.

[15] 史晶，高渝峰，陳少波，等. 吡咯烷二硫代氨基甲酸對(duì)百草枯中毒后肺損傷和Nrf2激活的影響[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2012，21（12）：1337-1341.

[16] Zhang C， Wang G， Zheng Z，et al. Endoplasmic reticulum-tethered transcription factor cAMP responsive element-binding protein， hepatocyte specific， regulates hepatic lipogenesis， fatty acid oxidation， and lipolysis upon metabolic stress in mice[J].Hepatology，2012，55（4）：1070-1082.

[17] Satoh T， Abiru N， Kobayashi M， et al. CHOP deletion does not impact the development of diabetes but suppresses the early production of insulin autoantibody in the NOD mouse[J].Apoptosis，2011，16（4）：438- 448.

[18] Inokuchi Y， Nakajima Y， Shimazawa M， et al. Effect of an inducer of Bip， a molecular chaperone，on endoplasmic reticulum（ER） stress-in-duced retinal cell death[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2009，50（1）：334- 344.

（收稿日期：2014-02-04）

（本文編輯：邵菊芳）

P998-1000