響應(yīng)面法優(yōu)化繁縷中總黃酮提取工藝及體外抗氧化作用研究

夏海濤+劉玉芬+李石英

摘要：用響應(yīng)面法優(yōu)化繁縷［Stellaria media（L.） Cyr.］中總黃酮類化合物的提取工藝，通過羥自由基、超氧陰離子自由基、總還原力試驗測定繁縷中總黃酮的體外抗氧化作用，并與抗壞血酸和叔丁基對苯二酚的抗氧化能力進行比較。結(jié)果表明，提取工藝最佳條件為提取溫度86 ℃、提取時間2.5 h、液料比V乙醇∶m繁縷粉為31.5∶1（mL∶g）、提取2次，該條件下總黃酮提取率預(yù)測值為3.907%，驗證值為3.879%。繁縷中總黃酮的還原能力、對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力均表現(xiàn)出較好的效果，清除超氧陰離子自由基和羥自由基的IC50分別為0.583 mg/mL和0.626 mg/mL，其抗氧化能力高于維生素C和叔丁基對苯二酚。

關(guān)鍵詞：繁縷［Stellaria media（L.） Cyr.］；黃酮；響應(yīng)面法；抗氧化作用

中圖分類號：S567.23+9;R284.2文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）08－１８７0-0５

Optimization of Extraction Process for Flavonoids from Stellaria media （L.） Cyr. by Response Surface Methodology and Evaluation of Their Antioxidant Activity in Vitro

XIA Hai-tao，LIU Yu-fen，LI Shi-ying

（College of Chemical Engineering， Huaihai Institute of Technology， Lianyungang 222005， Jiangsu， China）

Abstract：The conditions for extrating flavonoids from Stellaria media （L.） Cyr. were optimized by response surface methodology. The antioxidant activity in vitro was evaluated by hydroxyl radical scavenging assay， superoxide anion radical scavenging assay and total reducing power assay with vitamin C and tert-Butylhydroquinone as the reference. The results showed that the optimal extraction conditions were extraction temperature of 86 ℃， extraction time of 2.5 h， material-to-liquid ratio of 1∶31.5 and extracted twice. Under the optimal condition， the predicted and actual values of flavonoids yield were 3.907% and 3.879%， respectively. The antioxidant test showed that Stellaria media （L.） Cyr. flavonoids had excellent reducing power and high abilities to scavenge superoxide anion and hydroxyl free radicals with IC50 values of 0.583 mg/mL and 0.626 mg/mL， respectively. The antioxidant effect of flavonoids from Stellaria media （L.） Cyr. were higher than that of VC and TBHQ.

Key words：Stellaria media（L.） Cyr； flavonoids； response surface methodology； antioxidant activity

繁縷［Stellaria media（L.） Cyr.］又名雞草，是石竹科（Caryophyllaceae）繁縷屬（Stellaria）植物，生長于田間、路旁、林緣或溪邊草地，幾乎遍布全國各地［1］。該植物全草入藥，具有清熱解毒、活血化瘀、止痛、下乳、催生之功能。適用于治療痢疾、腸癰、肺癰、乳癰、疔瘡毒痛、痔瘡腫痛、出血、跌打損傷、產(chǎn)后瘀血腹痛、乳汁不下、乳腺炎、暑熱嘔吐等疾?。?-5］。繁縷含有黃酮、多糖、皂苷、脂肪酸、植物甾醇、維生素、氨基酸、微量元素等多種營養(yǎng)成分［6-11］，是一種很受大眾歡迎的無污染、高品質(zhì)的野生蔬菜，具有很好的營養(yǎng)、保健及藥用價值。目前對繁縷的研究主要集中在化學(xué)成分及分析方法、除草方法和除草藥劑、用分子生物學(xué)方法對繁縷進行鑒定等3個方面［12］，還沒有針對繁縷中總黃酮提取工藝的研究。本試驗對繁縷黃酮提取方法進行了研究，以期通過單因素和響應(yīng)面試驗確定各影響因素，優(yōu)化繁縷黃酮的提取工藝，研究繁縷黃酮的抗氧化作用，為繁縷的開發(fā)利用及深入研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

繁縷嫩莖葉采自江蘇省連云港市花果山，洗凈在60 ℃于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定，粉碎過60目篩。用石油醚浸泡去色，反復(fù)浸泡至無色，余下的固體粉末揮發(fā)干備用。

蘆丁標準品購自中國藥品生物制品檢定所；維生素C、叔丁基對苯二酚（TBHQ）、鄰苯三酚、水楊酸、硫代巴比妥酸、三羥基氨基甲烷、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、乙醇、石油醚、丙酮、氯仿等購自上海國藥集團試劑公司。

UV-2550型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；RE-5285A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；TDL-4 型臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2試驗方法

1.2.1黃酮提取工藝流程繁縷干粉→過篩→乙醇提取→離心→濾液→減壓濃縮→提取液定容→測定總黃酮含量。

具體操作步驟：稱取繁縷干粉5 g，置于三口瓶中，加入50%乙醇提取2次，濃縮提取液并定容，測定黃酮含量。

1.2.2總黃酮提取率的測定以蘆丁為標準品，參照文獻［13］得到蘆丁質(zhì)量濃度（C）在5～40 mg/L范圍內(nèi)對其在363 nm 波長處吸光度（A）的標準曲線回歸方程為：A＝0.001 7＋0.026 2C，r＝0.999 4。測定佛手總黃酮提取液的吸光值A(chǔ)363 nm，計算其中的總黃酮含量得到其提取率。

總黃酮提取率＝提取液中總黃酮含量×稀釋倍數(shù)×體積／原料質(zhì)量×100％。

1.2.3單因素試驗以繁縷中總黃酮提取率為指標分別考察乙醇溶液濃度、液料比（V乙醇：m繁縷粉，mL：g，下同）、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響，進行單因素試驗。①乙醇濃度對繁縷中總黃酮提取率的影響。在提取溫度70 ℃、提取時間1 h、液料比25∶1、提取1次的條件下，研究不同濃度乙醇（40％、50％、60％、70％、80％）對繁縷中總黃酮提取率的影響。②提取時間對繁縷中總黃酮提取率的影響。在提取溫度70 ℃、液料比25∶1、提取1次、50％乙醇作提取溶劑的條件下， 研究不同提取時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對繁縷中總黃酮提取率的影響。③提取溫度對繁縷中總黃酮提取率的影響。在液料比25∶1、提取1次、50％乙醇作提取溶劑、提取時間2 h的條件下， 研究不同提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）對繁縷中總黃酮提取率的影響。④液料比對繁縷中總黃酮提取率的影響。在提取1次、50％乙醇作提取溶劑、提取時間2 h、提取溫度70 ℃的條件下，研究不同液料比（20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1）對繁縷中總黃酮提取率的影響。⑤顆粒大小。在提取溫度70 ℃、液料比25∶1、提取1次、50％乙醇作提取溶劑、提取時間2h的條件下，研究不同原料顆粒（20、40、60、80目）對繁縷中總黃酮提取率的影響。

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取液料比、提取溫度、提取時間為Box-Behnken 設(shè)計的自變量，繁縷黃酮提取率為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化組合。因素與水平見表1，數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.05統(tǒng)計軟件分析。

1.2.5繁縷中總黃酮的抗氧化活性測定將提取液濃縮，烘干，用丙酮、氯仿等溶劑淋洗后，低溫干燥，配成黃酮質(zhì)量濃度500 mg/L的儲備液，用于抗氧化活性測定。以維生素C和TBHQ為對照，還原力、羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率的測定方法見文獻［14］。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1乙醇溶液對繁縷中總黃酮提取率的影響在提取溫度70 ℃、提取時間1 h、液料比25∶1的條件下，加入不同濃度的乙醇提取黃酮1次，定容測定吸光度，結(jié)果見圖1。由圖1可知，繁縷中總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大先升高，在乙醇濃度為50％時總黃酮提取率最高，之后再增加乙醇濃度，總黃酮提取率反而下降，故乙醇濃度選擇50％為宜。

2.1.2提取時間對繁縷中總黃酮提取率的影響以50％乙醇作為提取溶劑，考察不同提取時間對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，總黃酮提取率隨提取時間的延長先升高，提取時間超過2.5 h后總黃酮提取率不再升高，反而略有下降。因此，提取時間以2.5 h為宜。

2.1.3提取溫度對繁縷中總黃酮提取率的影響由圖3可知，總黃酮提取率隨著提取溫度的升高呈先升高后下降的趨勢，提取溫度為80 ℃時，總黃酮提取率最高，因此提取溫度以80 ℃為宜。

2.1.4液料比對繁縷中總黃酮提取率的影響由圖4可知，繁縷中總黃酮提取率隨提取溶劑用量的增大也呈先升高后下降的趨勢，V乙醇∶m繁縷粉為30∶1時黃酮提取率最大。因此以V乙醇∶m繁縷粉為30∶1為宜。

2.1.5顆粒大小對繁縷中總黃酮提取率的影響由圖5可知， 隨顆粒尺寸減小，總黃酮提取率增加， 顆粒尺寸達60目時黃酮提取率最高。當顆粒尺寸繼續(xù)減小時黃酮含量反而下降，可能是顆粒尺寸過小，接觸面積過大，致使繁縷中其他物質(zhì)也被萃取出來［15］，因此繁縷顆粒以60目為宜。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗優(yōu)化繁縷中總黃酮提取條件的結(jié)果見表2。將所得的試驗數(shù)據(jù)用Design Expert 軟件進行多元回歸擬合，得到繁縷中總黃酮提取率對提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）的二次多項回歸方程：Y＝3.755 0－0.396 6A－0.028 3B＋0.229 0C－0.041 5AB＋0.137 2AC －0.058 2BC－0.373 7A2－0.746 3B2－0.513 5C2。

由回歸模型的響應(yīng)面圖（圖6）可以看出，總黃酮提取率隨著各兩因素的增加先呈上升趨勢，當各兩因素達到某一水平時，總黃酮提取率增加緩慢，隨后下降。等高線的形狀可反映交互作用的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖6可見，AC兩因素交互作用的等高線呈橢圓形，表明這兩個因素之間有明顯的交互作用。

通過軟件Design－Expert 求解回歸方程，得到黃酮的最佳提取工藝條件為提取溫度85.89 ℃、提取時間2.48 h、V乙醇∶m繁縷粉＝31.52∶1，繁縷中黃酮提取率理論最高值可達3.907％?？紤]實際操作情況，將試驗條件修改為提取溫度86 ℃、提取時間2.5 h、V乙醇∶m繁縷粉＝31.5∶1。在此條件下以50％乙醇溶液作提取溶劑， 提取2次，重復(fù)3次， 所得繁縷中總黃酮提取率3.879％，與預(yù)測值偏差較小，證明該模型用于優(yōu)化篩選繁縷中總黃酮提取率提取工藝是可行的。

2.3體外抗氧化試驗結(jié)果

2.3.1繁縷中總黃酮的還原能力由圖7可知，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，繁縷黃酮的還原能力與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。在樣品質(zhì)量濃度小于0.2 mg/mL時，對Fe3+的還原作用能力大小順序為TBHQ＞繁縷黃酮＞維生素C，當樣品質(zhì)量濃度大于0.2 mg/mL時，對Fe3+的還原作用能力大小順序為繁縷黃酮＞TBHQ＞維生素C。說明繁縷黃酮的抗氧化性強于TBHQ和維生素C。

2.3.2羥自由基清除能力由圖8可知，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著繁縷黃酮質(zhì)量濃度的增加，對羥自由基的清除效果增強。根據(jù)線性回歸方程可以得到繁縷黃酮清除羥自由基的IC50為0.626 mg/mL，維生素C的IC50為0.657 mg/mL，TBHQ的IC50為0.799 mg/mL，說明繁縷黃酮清除羥自由基的能力高于TBHQ，與維生素C的能力相近。

2.3.3超氧陰離子自由基清除能力從圖9可知，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著繁縷黃酮質(zhì)量濃度的增大，對超氧陰離子自由基的清除作用增強，呈現(xiàn)量效關(guān)系。繁縷黃酮的IC50為0.583mg/mL，維生素C的IC50為0.742 mg/mL，TBHQ的IC50為0.832 mg/mL。由此可見繁縷黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力比維生素C和TBHQ高。

3小結(jié)與討論

利用響應(yīng)面法優(yōu)化繁縷黃酮的提取率，得到的最佳提取工藝修正條件為提取溫度86 ℃、提取時間2.5 h、V乙醇∶m繁縷粉＝31.5∶1。經(jīng)驗證該模型擬合程度高，準確有效。

體外抗氧化試驗結(jié)果表明，繁縷黃酮具有較強的還原能力、超氧陰離子自由基清除能力和羥自由基清除能力。與同質(zhì)量濃度維生素C和TBHQ相比，繁縷黃酮的超氧自由基清除能力和還原能力更強，而羥自由基清除能力與維生素C相近，但高于TBHQ。

繁縷廣泛分布在中國各地，野生資源非常豐富、成本低廉，作為一種潛在黃酮的提取源和抗氧化劑，具有廣泛的應(yīng)用前景和開發(fā)價值。

參考文獻:

［１］ 鄭玉紅，趙海光，單宇，等．繁縷種質(zhì)資源研究進展［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１０，３８（２）：７３１－７３４．

［２］ 馬利華，陳斌，謝東浩，等． 繁縷屬植物抗病毒活性物質(zhì)基礎(chǔ)組分結(jié)構(gòu)研究［Ｊ］． 中草藥， ２０１２，４３（４）：７９９－８０４．

［３］ 陳興榮，胡永美，汪豪， 等． 繁縷的黃酮類化學(xué)成分研究［Ｊ］． 現(xiàn)代中藥研究與實踐， ２００５， １９（４）： ４１－４３．

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［８］ 單 宇，周建建，鄭玉紅，等．繁縷葉蛋白中氨基酸組成研究［Ｊ］． 食品研究與開發(fā)，２０１０，３１（１１）：１８１－１８３．

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［１４］ 劉玉芬，夏海濤． 響應(yīng)面法優(yōu)化堿蒿黃酮提取工藝及其體外抗氧化作用［Ｊ］． 食品科學(xué)，２０１２，３３（１２）：６３－６８．

［１５］ 張志紅，何楨，郭偉．在響應(yīng)曲面方法中三類中心復(fù)合設(shè)計的比較研究［Ｊ］． 沈陽航空工業(yè)學(xué)院學(xué)報，２００７，２４（１）： ８７－９１．

（責任編輯程碧軍）

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取液料比、提取溫度、提取時間為Box-Behnken 設(shè)計的自變量，繁縷黃酮提取率為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化組合。因素與水平見表1，數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.05統(tǒng)計軟件分析。

1.2.5繁縷中總黃酮的抗氧化活性測定將提取液濃縮，烘干，用丙酮、氯仿等溶劑淋洗后，低溫干燥，配成黃酮質(zhì)量濃度500 mg/L的儲備液，用于抗氧化活性測定。以維生素C和TBHQ為對照，還原力、羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率的測定方法見文獻［14］。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1乙醇溶液對繁縷中總黃酮提取率的影響在提取溫度70 ℃、提取時間1 h、液料比25∶1的條件下，加入不同濃度的乙醇提取黃酮1次，定容測定吸光度，結(jié)果見圖1。由圖1可知，繁縷中總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大先升高，在乙醇濃度為50％時總黃酮提取率最高，之后再增加乙醇濃度，總黃酮提取率反而下降，故乙醇濃度選擇50％為宜。

2.1.2提取時間對繁縷中總黃酮提取率的影響以50％乙醇作為提取溶劑，考察不同提取時間對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，總黃酮提取率隨提取時間的延長先升高，提取時間超過2.5 h后總黃酮提取率不再升高，反而略有下降。因此，提取時間以2.5 h為宜。

2.1.3提取溫度對繁縷中總黃酮提取率的影響由圖3可知，總黃酮提取率隨著提取溫度的升高呈先升高后下降的趨勢，提取溫度為80 ℃時，總黃酮提取率最高，因此提取溫度以80 ℃為宜。

2.1.4液料比對繁縷中總黃酮提取率的影響由圖4可知，繁縷中總黃酮提取率隨提取溶劑用量的增大也呈先升高后下降的趨勢，V乙醇∶m繁縷粉為30∶1時黃酮提取率最大。因此以V乙醇∶m繁縷粉為30∶1為宜。

2.1.5顆粒大小對繁縷中總黃酮提取率的影響由圖5可知， 隨顆粒尺寸減小，總黃酮提取率增加， 顆粒尺寸達60目時黃酮提取率最高。當顆粒尺寸繼續(xù)減小時黃酮含量反而下降，可能是顆粒尺寸過小，接觸面積過大，致使繁縷中其他物質(zhì)也被萃取出來［15］，因此繁縷顆粒以60目為宜。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗優(yōu)化繁縷中總黃酮提取條件的結(jié)果見表2。將所得的試驗數(shù)據(jù)用Design Expert 軟件進行多元回歸擬合，得到繁縷中總黃酮提取率對提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）的二次多項回歸方程：Y＝3.755 0－0.396 6A－0.028 3B＋0.229 0C－0.041 5AB＋0.137 2AC －0.058 2BC－0.373 7A2－0.746 3B2－0.513 5C2。

由回歸模型的響應(yīng)面圖（圖6）可以看出，總黃酮提取率隨著各兩因素的增加先呈上升趨勢，當各兩因素達到某一水平時，總黃酮提取率增加緩慢，隨后下降。等高線的形狀可反映交互作用的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖6可見，AC兩因素交互作用的等高線呈橢圓形，表明這兩個因素之間有明顯的交互作用。

通過軟件Design－Expert 求解回歸方程，得到黃酮的最佳提取工藝條件為提取溫度85.89 ℃、提取時間2.48 h、V乙醇∶m繁縷粉＝31.52∶1，繁縷中黃酮提取率理論最高值可達3.907％。考慮實際操作情況，將試驗條件修改為提取溫度86 ℃、提取時間2.5 h、V乙醇∶m繁縷粉＝31.5∶1。在此條件下以50％乙醇溶液作提取溶劑， 提取2次，重復(fù)3次， 所得繁縷中總黃酮提取率3.879％，與預(yù)測值偏差較小，證明該模型用于優(yōu)化篩選繁縷中總黃酮提取率提取工藝是可行的。

2.3體外抗氧化試驗結(jié)果

2.3.1繁縷中總黃酮的還原能力由圖7可知，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，繁縷黃酮的還原能力與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。在樣品質(zhì)量濃度小于0.2 mg/mL時，對Fe3+的還原作用能力大小順序為TBHQ＞繁縷黃酮＞維生素C，當樣品質(zhì)量濃度大于0.2 mg/mL時，對Fe3+的還原作用能力大小順序為繁縷黃酮＞TBHQ＞維生素C。說明繁縷黃酮的抗氧化性強于TBHQ和維生素C。

2.3.2羥自由基清除能力由圖8可知，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著繁縷黃酮質(zhì)量濃度的增加，對羥自由基的清除效果增強。根據(jù)線性回歸方程可以得到繁縷黃酮清除羥自由基的IC50為0.626 mg/mL，維生素C的IC50為0.657 mg/mL，TBHQ的IC50為0.799 mg/mL，說明繁縷黃酮清除羥自由基的能力高于TBHQ，與維生素C的能力相近。

2.3.3超氧陰離子自由基清除能力從圖9可知，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著繁縷黃酮質(zhì)量濃度的增大，對超氧陰離子自由基的清除作用增強，呈現(xiàn)量效關(guān)系。繁縷黃酮的IC50為0.583mg/mL，維生素C的IC50為0.742 mg/mL，TBHQ的IC50為0.832 mg/mL。由此可見繁縷黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力比維生素C和TBHQ高。

3小結(jié)與討論

利用響應(yīng)面法優(yōu)化繁縷黃酮的提取率，得到的最佳提取工藝修正條件為提取溫度86 ℃、提取時間2.5 h、V乙醇∶m繁縷粉＝31.5∶1。經(jīng)驗證該模型擬合程度高，準確有效。

體外抗氧化試驗結(jié)果表明，繁縷黃酮具有較強的還原能力、超氧陰離子自由基清除能力和羥自由基清除能力。與同質(zhì)量濃度維生素C和TBHQ相比，繁縷黃酮的超氧自由基清除能力和還原能力更強，而羥自由基清除能力與維生素C相近，但高于TBHQ。

繁縷廣泛分布在中國各地，野生資源非常豐富、成本低廉，作為一種潛在黃酮的提取源和抗氧化劑，具有廣泛的應(yīng)用前景和開發(fā)價值。

參考文獻:

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［７］ 周建建，單宇，鄭玉紅，等．繁縷葉蛋白提取工藝研究［Ｊ］． 食品科學(xué)，２００９，３０（６）：１０９－１１２．

［８］ 單 宇，周建建，鄭玉紅，等．繁縷葉蛋白中氨基酸組成研究［Ｊ］． 食品研究與開發(fā)，２０１０，３１（１１）：１８１－１８３．

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（責任編輯程碧軍）

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取液料比、提取溫度、提取時間為Box-Behnken 設(shè)計的自變量，繁縷黃酮提取率為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化組合。因素與水平見表1，數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.05統(tǒng)計軟件分析。

1.2.5繁縷中總黃酮的抗氧化活性測定將提取液濃縮，烘干，用丙酮、氯仿等溶劑淋洗后，低溫干燥，配成黃酮質(zhì)量濃度500 mg/L的儲備液，用于抗氧化活性測定。以維生素C和TBHQ為對照，還原力、羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率的測定方法見文獻［14］。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1乙醇溶液對繁縷中總黃酮提取率的影響在提取溫度70 ℃、提取時間1 h、液料比25∶1的條件下，加入不同濃度的乙醇提取黃酮1次，定容測定吸光度，結(jié)果見圖1。由圖1可知，繁縷中總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大先升高，在乙醇濃度為50％時總黃酮提取率最高，之后再增加乙醇濃度，總黃酮提取率反而下降，故乙醇濃度選擇50％為宜。

2.1.2提取時間對繁縷中總黃酮提取率的影響以50％乙醇作為提取溶劑，考察不同提取時間對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，總黃酮提取率隨提取時間的延長先升高，提取時間超過2.5 h后總黃酮提取率不再升高，反而略有下降。因此，提取時間以2.5 h為宜。

2.1.3提取溫度對繁縷中總黃酮提取率的影響由圖3可知，總黃酮提取率隨著提取溫度的升高呈先升高后下降的趨勢，提取溫度為80 ℃時，總黃酮提取率最高，因此提取溫度以80 ℃為宜。

2.1.4液料比對繁縷中總黃酮提取率的影響由圖4可知，繁縷中總黃酮提取率隨提取溶劑用量的增大也呈先升高后下降的趨勢，V乙醇∶m繁縷粉為30∶1時黃酮提取率最大。因此以V乙醇∶m繁縷粉為30∶1為宜。

2.1.5顆粒大小對繁縷中總黃酮提取率的影響由圖5可知， 隨顆粒尺寸減小，總黃酮提取率增加， 顆粒尺寸達60目時黃酮提取率最高。當顆粒尺寸繼續(xù)減小時黃酮含量反而下降，可能是顆粒尺寸過小，接觸面積過大，致使繁縷中其他物質(zhì)也被萃取出來［15］，因此繁縷顆粒以60目為宜。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗優(yōu)化繁縷中總黃酮提取條件的結(jié)果見表2。將所得的試驗數(shù)據(jù)用Design Expert 軟件進行多元回歸擬合，得到繁縷中總黃酮提取率對提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）的二次多項回歸方程：Y＝3.755 0－0.396 6A－0.028 3B＋0.229 0C－0.041 5AB＋0.137 2AC －0.058 2BC－0.373 7A2－0.746 3B2－0.513 5C2。

由回歸模型的響應(yīng)面圖（圖6）可以看出，總黃酮提取率隨著各兩因素的增加先呈上升趨勢，當各兩因素達到某一水平時，總黃酮提取率增加緩慢，隨后下降。等高線的形狀可反映交互作用的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖6可見，AC兩因素交互作用的等高線呈橢圓形，表明這兩個因素之間有明顯的交互作用。

通過軟件Design－Expert 求解回歸方程，得到黃酮的最佳提取工藝條件為提取溫度85.89 ℃、提取時間2.48 h、V乙醇∶m繁縷粉＝31.52∶1，繁縷中黃酮提取率理論最高值可達3.907％。考慮實際操作情況，將試驗條件修改為提取溫度86 ℃、提取時間2.5 h、V乙醇∶m繁縷粉＝31.5∶1。在此條件下以50％乙醇溶液作提取溶劑， 提取2次，重復(fù)3次， 所得繁縷中總黃酮提取率3.879％，與預(yù)測值偏差較小，證明該模型用于優(yōu)化篩選繁縷中總黃酮提取率提取工藝是可行的。

2.3體外抗氧化試驗結(jié)果

2.3.1繁縷中總黃酮的還原能力由圖7可知，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，繁縷黃酮的還原能力與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。在樣品質(zhì)量濃度小于0.2 mg/mL時，對Fe3+的還原作用能力大小順序為TBHQ＞繁縷黃酮＞維生素C，當樣品質(zhì)量濃度大于0.2 mg/mL時，對Fe3+的還原作用能力大小順序為繁縷黃酮＞TBHQ＞維生素C。說明繁縷黃酮的抗氧化性強于TBHQ和維生素C。

2.3.2羥自由基清除能力由圖8可知，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著繁縷黃酮質(zhì)量濃度的增加，對羥自由基的清除效果增強。根據(jù)線性回歸方程可以得到繁縷黃酮清除羥自由基的IC50為0.626 mg/mL，維生素C的IC50為0.657 mg/mL，TBHQ的IC50為0.799 mg/mL，說明繁縷黃酮清除羥自由基的能力高于TBHQ，與維生素C的能力相近。

2.3.3超氧陰離子自由基清除能力從圖9可知，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著繁縷黃酮質(zhì)量濃度的增大，對超氧陰離子自由基的清除作用增強，呈現(xiàn)量效關(guān)系。繁縷黃酮的IC50為0.583mg/mL，維生素C的IC50為0.742 mg/mL，TBHQ的IC50為0.832 mg/mL。由此可見繁縷黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力比維生素C和TBHQ高。

3小結(jié)與討論

利用響應(yīng)面法優(yōu)化繁縷黃酮的提取率，得到的最佳提取工藝修正條件為提取溫度86 ℃、提取時間2.5 h、V乙醇∶m繁縷粉＝31.5∶1。經(jīng)驗證該模型擬合程度高，準確有效。

體外抗氧化試驗結(jié)果表明，繁縷黃酮具有較強的還原能力、超氧陰離子自由基清除能力和羥自由基清除能力。與同質(zhì)量濃度維生素C和TBHQ相比，繁縷黃酮的超氧自由基清除能力和還原能力更強，而羥自由基清除能力與維生素C相近，但高于TBHQ。

繁縷廣泛分布在中國各地，野生資源非常豐富、成本低廉，作為一種潛在黃酮的提取源和抗氧化劑，具有廣泛的應(yīng)用前景和開發(fā)價值。

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