內(nèi)皮型一氧化氮合酶Glu298Asp基因多態(tài)性與老年原發(fā)性高血壓微量白蛋白尿的關(guān)系

王健??戴云湘??鄭瑋??毛擁軍

[摘要] 目的 研究?jī)?nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）Glu298Asp基因多態(tài)性與老年原發(fā)性高血壓（EH）微量白蛋白尿（MAU）的關(guān)系。方法 從到醫(yī)院就診的老年EH患者中篩選出202例無(wú)顯性蛋白尿的患者，行24h MAU測(cè)定，并應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)eNOS Glu298Asp基因多態(tài)性，按照24hMAU定量分為MAU組和非MAU組（NAU組），比較兩組基因型和等位基因分布差異。 結(jié)果 兩組等位基因和基因型的分布不同，MAU組等位基因T及含等位基因T的基因型（GT+TT）分布頻率明顯升高（x2=6.62 ，P<0.01；x2=7.29，P<0.01）；T等位基因變異使老年EH患者M(jìn)AU的相對(duì)危險(xiǎn)度顯著增高（OR=2.361，95%CI=1.256～4.437）。結(jié)論 T等位基因是老年EH患者M(jìn)AU的易感基因，攜帶T等位基因?qū)е吕夏闑H患者出現(xiàn)MAU的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。

[關(guān)鍵詞] 內(nèi)皮型一氧化氮合酶；基因多態(tài)性；老年原發(fā)性高血壓；微量白蛋白尿

[中圖分類號(hào)] R544.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）18-23-04

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是遺傳易感性和環(huán)境因素相互影響所致的全身性疾病。EH人群中有相當(dāng)數(shù)量的人合并微量白蛋白尿，（microalbuminuria，MAU）的出現(xiàn)是全身性血管內(nèi)皮受損的標(biāo)志，也是EH患者亞臨床心血管病變（靶器官損害）的早期標(biāo)志[1]。老年人血壓波動(dòng)大，合并癥多，更易導(dǎo)致靶器官損害，內(nèi)皮基因多態(tài)性與EH并發(fā)蛋白尿之間的關(guān)系國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。本研究從基因水平上就老年人血管內(nèi)皮與EH并發(fā)蛋白尿之間的關(guān)系作一探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對(duì)2008～2013年到我院就診的老年（年齡≥60歲）EH患者進(jìn)行內(nèi)皮型一氧化氮分酶 （endothelial nitric oxide synthase，eNOS）Glu298Asp基因多態(tài)性分析并晨尿尿常規(guī)檢查，排除顯性蛋白尿的患者202例入選本研究。其中男103例，女99例；年齡（73.3±7.6）歲。對(duì)入選病例進(jìn)行24h尿白蛋白排泄率（24hUAER）檢測(cè)，按照尿微量白蛋白定量分為MAU（24hUAER≥30mg）組和NAU（24hUAER<30mg）組。排除繼發(fā)性高血壓，糖尿病，原發(fā)性腎臟疾病，風(fēng)濕免疫性疾病，泌尿系結(jié)石，高尿酸血癥及藥物引起的腎臟損害等。

1.2 方法

1.2.1 尿微量白蛋白定量分析 收集早晨7時(shí)至次晨7時(shí)的24h尿量，采用放射免疫法進(jìn)行24hUAER定量檢測(cè)，30mg/L≤24hUAER<300mg/L為MAU組，24hUAER<30mg/L為NAU組，符合以上條件的患者入選本實(shí)驗(yàn)。24hUAER≥300mg/L為顯性蛋白尿，應(yīng)排除在外。每位患者均在不同時(shí)間接受3次檢驗(yàn)，取其平均值。

1.2.2 基因分析 基因多態(tài)性檢測(cè)用上海百傲生物技術(shù)有限公司提供的基因芯片檢測(cè)eNOS Glu298Asp等位點(diǎn)基因多態(tài)性（等位基因298Glu簡(jiǎn)寫為E，298Asp簡(jiǎn)寫為D）。檢測(cè)方法如下：（1）抽取被檢者肘靜脈血2mL，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。（2）用快速裂解法提取基因組DNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增eNOS基因的特異片段：向各擴(kuò)增液管中加入Taq酶管溶液0.8mL后，分別加入陰性對(duì)照管溶液、陽(yáng)性對(duì)照管溶液或抽提好的樣品上清液，混勻，再放入PCR儀中，按下列條件擴(kuò)增：94℃25s，56℃25s，72℃25s，做40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。取各管PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于98℃熱變性5min，取出后迅速放入冰盒，-20℃放置。（3）雜交、顯色及結(jié)果檢測(cè)在雜交倉(cāng)中基因芯片與已變性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合物混勻雜交。向雜交倉(cāng)中加入顯色液溶液，44℃放置40min。將顯色載玻片置于BaiO基因生物芯片只讀儀上進(jìn)行檢測(cè)，圖像Array Doctor軟件分析可自動(dòng)輸出檢測(cè)結(jié)果，最后檢測(cè)出eNOS基因的多態(tài)性位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組間計(jì)量資料的比較t檢驗(yàn)，結(jié)果以（）表示；計(jì)數(shù)資料比較采用x2檢驗(yàn)；基因型及等位基因的相對(duì)危險(xiǎn)度以優(yōu)勢(shì)比（OR）及95%可信區(qū)間（CI）表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組的基因型分布頻率符合Hardy-winberg平衡

對(duì)MAU組和NAU組的eNOS Glu298Asp進(jìn)行基因多態(tài)性遺傳平衡檢驗(yàn)，基因型分布測(cè)定值與預(yù)計(jì)值比較，進(jìn)行x2檢驗(yàn)。兩組的基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律（P>0.05），表明標(biāo)本具有群體代表性。

2.2 兩組臨床資料比較

兩組的年齡、性別、吸煙率、高血壓病程、腰圍/臀圍（WHR）、體重指數(shù)（BMI）及總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 患者臨床基線資料特征（）

組別 MAU組 NAU組 P

性別（男/女） 97（48/49） 105（55/50） 0.68*

吸煙（%） 32.0 27.6 0.50#

年齡（歲） 73.01±7.747 73.54±7.459 0.62

TG（mmol/L） 2.085 8±0.583 93 2.051 5±0.637 78 0.69

TC（mmol/L） 4.953 9±1.061 28 4.922 3±1.036 49 0.83

LDL-C（mmol/L） 3.344 8±1.040 23 3.378 6±0.829 89 0.80endprint

BMI（kg/m2） 24.243 6±1.168 77 24.454 7±1.121 66 0.19

WHR 0.799 0±0.047 49 0.802 5±0.048 89 0.60

EH病程（年） 14.350 5±8.536 74 14.857 1±6.964 79 0.64

注：*x2=0.169；#x2=0.455

2.3 MAU組與非MAU組eNOS Glu298Asp基因分布頻率的比較

在本檢測(cè)結(jié)果中，因TT基因型例數(shù)太少（見(jiàn)表2），TT和GT基因型被合并處理（見(jiàn)表3）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，MAU組T等位基因及含T基因型比例高于NAU組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（前者P<0.05，后者P<0.01）。與不攜帶T等位基因相人群相比較，攜帶T等位基因的人群發(fā)生MAU危險(xiǎn)性高（OR=2.361，95%CI=1.256～4.437）。見(jiàn)表2。

3 討論

EH患者，特別是老年人，多存在胰島素抵抗，eNOS活性減弱，一氧化氮合成及釋放減少，內(nèi)皮依賴性血管舒張功能嚴(yán)重受損，血管床的緊張性、血管壁的通透性增高，腎臟血管痙攣收縮，腎血流下

降、腎小管重吸收功能減退而出現(xiàn)蛋白尿[2]。目前的研究也證實(shí)了內(nèi)皮依賴性舒張功能與MAU的發(fā)生密切相關(guān)[3]。

本研究將eNOS基因第7外顯子Glu298Asp（G894T）突變作為篩查目標(biāo)，探討單基因突變與老年高血壓患者M(jìn)AU易感性的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，與非MAU組相比較，MAU組Glu/Asp基因型的分布頻率有顯著差異，eNOS基因298Glu→Asp變異顯著增加老年EH患者M(jìn)AU的危險(xiǎn)，多因素回歸分析顯示MAU與Glu/Asp基因的分布頻率有關(guān)，而且排除高血壓因素的影響后仍有意義。有學(xué)者認(rèn)為，eNOS基因外顯子7上894位核苷酸位點(diǎn)G→T的突變，導(dǎo)致構(gòu)象由α螺旋變?yōu)榫o密折疊[4]，從而影響eNOS的功能，NO生成減少，導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損。eNOS輔因子（如NADPH）缺乏可能與患者NO合成減少有關(guān)[5-7]，由于eNOS以NADPH為輔酶，eNOS基因的298Glu/298Asp基因型存在時(shí)，可能由于消耗了大量的NADPH，導(dǎo)致NO生成進(jìn)一步減少，從而促進(jìn)心、腎微血管床的損害。

目前關(guān)于eNOS基因Glu298Asp多態(tài)性與MAU的關(guān)系國(guó)內(nèi)外報(bào)道不一。董硯虎[8]，付正菊[9]，Young Shin Shin[10]，Intissar Ezzidi等[11]研究認(rèn)為，eNOS基因第7外顯子G894T點(diǎn)突變可能與糖尿病腎病的進(jìn)展有關(guān)。而Hiroyuki Tamemoto[12]，Dell'Omo G等[13]研究則認(rèn)為，eNOSGlu298Asp基因的GluAsp或AspAsp基因型與白蛋白尿無(wú)關(guān)。Jachymova等[14]發(fā)現(xiàn)捷克高加索人群eNOS基因的Glu298Asp多態(tài)性可能是患者對(duì)傳統(tǒng)降壓治療的抵抗因素之一，T等位基因可能是患者的治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)因素。Chen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，eNOS基因G894T多態(tài)性與白人的EH危險(xiǎn)、胰島素抵抗有關(guān)。Srivastava等[16]研究認(rèn)為Glu298Asp基因多態(tài)性與亞洲人高血壓相關(guān)。Khawaja等[17]研究包括146例高血壓和186例對(duì)照者的研究未發(fā)現(xiàn)G894T與巴基斯坦成人高血壓相關(guān)。

目前有關(guān)MAU易感基因的研究較多，結(jié)果不一。MAU可能受多基因變異的共同影響，且存在人種和地域差異，單基因突變的研究很難對(duì)其靶基因進(jìn)行準(zhǔn)確判定和選擇，多基因之間的相互聯(lián)系已逐漸引起人們的重視。這就需要我們進(jìn)行多基因聯(lián)合檢測(cè)，積極探討各易感基因之間的交互作用，以期早日明確MAU的影響因素，對(duì)靶器官的損害進(jìn)行早期防治。

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