1，2，3－三氮唑橋連水楊醛類席夫堿菊糖衍生物的合成及抑菌活性研究

胡云霞，李琬聰，周婷婷，郭占勇

（1.中國科學院煙臺海岸帶研究所 海岸帶生物學與生物資源利用重點實驗室，山東 煙臺264003；2.中國科學院大學，北京100049）

菊糖廣泛存在于30 000多種植物中，是一種天然的、可生物降解的植物性多糖[1－2］，在菊苣、菊芋、雪蓮果、大麗花等菊科植物的塊根塊莖中儲量較為豐富[3］。通過對菊糖高附加值利用的研究，可以提高菊糖的經(jīng)濟價值，研發(fā)新型農(nóng)業(yè)殺菌劑，減輕環(huán)境污染，改善人們生活質(zhì)量，調(diào)動人們種植菊芋等鹽生植物的積極性，推動生態(tài)環(huán)境的修復和利用。國內(nèi)外對于菊糖的研究大多集中在菊糖的提取純化、菊糖自身的生理功能等方面，對于菊糖化學修飾的研究也多為酯化、醚化、羧甲基化等作為表面活性劑應用于洗滌劑等日用化工行業(yè)[4－5］，關于菊糖衍生物作為農(nóng)業(yè)領域中抗菌劑、殺菌劑的應用鮮有報道。

席夫堿的基本結(jié)構(gòu)中含有亞胺（－CH＝N）結(jié)構(gòu)，可通過活潑的羰基與氨基反應得到，其特有的化學結(jié)構(gòu)賦予席夫堿優(yōu)良的生物化學活性，廣泛應用于抗菌劑、消炎劑等的合成[6］。

1，2，3－三氮唑類氮雜環(huán)化合物具有廣泛的生物活性，在抗真菌、抗細菌、抗HIV以及治療關節(jié)炎、神經(jīng)性精神錯亂和惡性腫瘤方面有顯著療效[7］，廣泛應用于DNA、RNA、多肽和糖類等化合物的結(jié)構(gòu)改造中，并表現(xiàn)出良好的效果。

鑒于此，作者根據(jù)活性疊加原理，首先利用丙炔胺與水楊醛及其鹵代衍生物合成席夫堿中間體，然后再通過Huisgen－Click反應（即一價銅鹽催化端基炔和疊氮化合物發(fā)生1，3－偶極環(huán)加成生成1，4－二取代1，2，3－三氮唑的反應[8－9］），將中間體與疊氮代菊糖分子通過1，2，3－三氮唑橋連，最后對橋連產(chǎn)物脫乙?；玫胶?，2，3－三氮唑和席夫堿官能團的新型菊糖衍生物（4a～4c），并測定其抑菌活性、評價其殺菌性能，為尋找環(huán)境友好、低毒、安全、高效的生物抑菌制劑提供參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

菊糖（純度≥90%），北京威德生物科技有限公司。

黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum lagenarium）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、蘆筍莖枯病菌（Phomopsis asparagi）均來自青島農(nóng)業(yè)科學院。

丙炔胺、水楊醛、5－氯水楊醛、5－溴水楊醛、N－溴代丁二酰亞胺（NBS）、三苯基膦（PPh3）、疊氮鈉（NaN3）、三乙胺（Et3N）、乙酸酐（Ac2O）、N，N－二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）等合成實驗所用試劑均為分析純；真菌培養(yǎng)基、瓊脂粉等活性實驗所用試劑均為生化純；多菌靈。

XS10500型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；MF－D105型恒溫油浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FD－1C－80型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；FTIR－6300型紅外光譜儀，日本Jasco公司；SWCJ－2F型超凈工作臺，蘇州安泰有限責任公司；LOZX－50KB型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SHZ－B型水浴恒溫振蕩器，上海博訊實業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 合成路線（圖1）

圖1 目標化合物4a～4c的合成路線Fig.1 Synthetic route of target compounds 4a～4c

1.2.2 合成方法

1）水楊醛類丙炔胺席夫堿（1a～1c）的合成[10］

分別取水楊醛、5－氯水楊醛、5－溴水楊醛10mmol溶于50mL乙醇中，攪拌，恒壓緩慢滴加10mmol丙炔胺，于70℃水浴回流反應4h，反應結(jié)束后靜置冷卻，待結(jié)晶后過濾，冷凍干燥，得化合物1a～1c。

2）C－6脫氧疊氮代乙酰化菊糖衍生物（2）的合成[11－12］

取10mmol菊糖、50mmol NBS溶于100mL DMF中，冰浴條件下攪拌至溶解完全；取50mmol PPh3溶于50mL DMF中，緩慢加入反應液中，冰浴條件下繼續(xù)攪拌20min，然后置于80℃油浴中反應3 h；用丙酮沉淀，洗滌，抽濾，將所得產(chǎn)物溶于100mL吡啶中，加入15mL乙酸酐，室溫反應12h；用冰水沉淀，洗滌，索氏提取36h，冷凍干燥，得C－6脫氧溴代乙?；仗?；取10mmol溶于100mL DMF中，加入15 mmol NaN3，于80℃反應4h；用冰水沉淀，洗滌，索氏提取36h，冷凍干燥，得化合物2。

3）1，2，3－三氮唑橋連水楊醛類席夫堿乙?；仗茄苌铮?a～3c）的合成[12］

取10mmol化合物2溶于150mL DMSO中，然后加入1mmol CuI和10mmol Et3N，于70℃油浴條件下攪拌，用恒壓漏斗分別滴加15mmol化合物1a～1c，惰性氣體保護，攪拌48h，反應結(jié)束冷卻至室溫，用乙醚－異丙醇（3∶1）400mL沉淀，抽濾，用水洗滌，冷凍干燥，得化合物3a～3c。

4）1，2，3－三氮唑橋連水楊醛類席夫堿菊糖衍生物（4a～4c）的合成

分別取1mmol化合物3a～3c于10mL 2mmol·mL－1的 MeOH／MeONa溶液中，室溫攪拌3h，抽濾，甲醇洗滌，冷凍干燥，得目標化合物4a～4c。

1.2.3 紅外光譜分析

采用KBr壓片法，在4 000～400cm－1范圍內(nèi)掃描，進行紅外光譜分析。

1.2.4 抑菌活性測定

采用菌絲生長速率法[13］研究目標化合物4a～4c在濃度分別為1 000μg·mL－1、500μg·mL－1、100 μg·mL－1時對黃瓜炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、蘆筍莖枯病菌的抑制活性：將冰箱內(nèi)保存的菌種經(jīng)2次轉(zhuǎn)管復壯后備用，用直徑5mm的打孔器在新鮮菌落的外圍打取菌餅接種；然后置于27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h或72h后，用十字交叉法測量菌落直徑（D）。每個樣品重復測定2次，以商品化多菌靈為對照藥劑，等量蒸餾水為空白對照。依下式計算抑菌率：

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

菊糖、化合物2、3a～3c以及目標化合物4a～4c的紅外光譜如圖2所示。

圖2 菊糖、化合物2、3a～3c、4a～4c的紅外光譜Fig.2 FTIR Spectra of inulin，compound 2，3a～3c，4a～4c

從圖2可知：菊糖骨架的特征峰為848cm－1、1 029cm－1和3 390cm－1；與菊糖相比，化合物2紅外光譜中新增加的2 105cm－1處的吸收峰為疊氮基的強烈振動峰[14］，1 735cm－1處為乙酸酐保護后引入的乙酰基的特征吸收峰[15］；當疊氮代乙酰菊糖與水楊醛類丙炔胺席夫堿中間體通過1，2，3－三氮唑橋連后，化合物3a～3c紅外光譜中疊氮基2 105cm－1處的強烈振動峰消失，同時在1 527～1 531cm－1、1 461～1 465 cm－1、713～821cm－1、651～659cm－1范圍內(nèi)出現(xiàn)振動吸收，推斷為苯環(huán)和三唑環(huán)的振動疊加特征峰[12－15］，1 627～1 631cm－1處出現(xiàn)席夫堿－CH＝N基團的特征吸收峰[16］，1 041～1 045cm－1處的吸收峰與化合物2相比明顯增強，推斷為1，2，3－三氮唑上與菊糖C－6位相連的C－N的特征吸收峰；用MeOH／MeONa脫保護后，化合物4a～4c的紅外光譜中1 735cm－1左右的吸收峰消失，其它特征峰沒有明顯變化。證明水楊醛類丙炔胺席夫堿已經(jīng)通過Huisgen－Click反應與菊糖橋連生成含1，2，3－三氮唑的水楊醛類席夫堿的菊糖衍生物。

2.2 目標化合物4a～4c的抑菌活性

不同濃度下，菊糖、化合物4a～4c對黃瓜炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、蘆筍莖枯病菌的抑菌率如圖3所示。

圖3 菊糖、化合物4a～4c對黃瓜炭疽病菌（a）、西瓜枯萎病菌（b）、蘆筍莖枯病菌（c）的抑菌活性Fig.3 Antifungal activities of inulin，compound 4a～4cagainst Colletotrichum lagenarium（a），F(xiàn)usarium oxysporium（b），Phomopsis asparagi（c）

從圖3可看出，菊糖沒有明顯的抑菌活性，而目標化合物4a～4c的抑菌活性明顯強于菊糖，且隨著濃度的增大逐漸增強?；衔?a的抑菌活性最好，500μg·mL－1時，對3種植物真菌的抑制率分別為40.5%、33.3%、41.9%，高 于 菊 糖 的 8.3%、6.2%、9.7%；1 000μg·mL－1時，對3種植物真菌的抑菌率分別達66.7%、42.0%、58.1%，遠 高 于 菊 糖 的 8.3%、11.3%、9.9%。化合物4a～4c對黃瓜炭疽病菌的抑菌活性強于西瓜枯萎病菌和蘆筍莖枯病菌。在500 μg·mL－1和1 000μg·mL－1時，化合物4a～4c對3種植物真菌的抑菌活性均強于菊糖。

2.3 討論

Huisgen－Click反應一般需要疊氮基和端基炔2個配體。本實驗首先通過溴代激活菊糖C－6位的羥基，使其變成易離去基團，然后疊氮基進攻易離去基團，發(fā)生SN親核置換反應，將溴取代得到疊氮代配體。

菊糖是一種多羥基化合物，具有較強的吸濕性、水溶性，在大多數(shù)有機溶劑中的溶解性均十分優(yōu)良，增大了反應后處理的難度，同時也降低了產(chǎn)率。為了解決該問題，本實驗先采用“一鍋法”利用乙酸酐對溴代菊糖上的極性羥基進行乙?；Ｗo，制備得到疏水性溴代乙?；仗茄苌?，使得反應后處理過程中可以對產(chǎn)物直接用水沉淀并且洗滌，大大提高了反應中間體的產(chǎn)率；然后再利用 MeOH／MeONa對1，2，3－三氮唑橋連水楊醛類席夫堿乙?；仗茄苌锩撘阴；尫帕u基，增大目標產(chǎn)物的極性，以使其更好地分散于水中，有利于發(fā)揮抑菌活性。

由抑菌結(jié)果可以看出，不同鹵素取代基的抑菌活性相差不大，且低于不含鹵素衍生物的抑菌活性。表明，芳環(huán)上取代基的吸電子效應對化合物抑菌活性的提高沒有明顯作用。在菊糖分子中引入席夫堿和1，2，3－三氮唑，可以明顯提高菊糖對真菌的抑制活性，實現(xiàn)活性疊加的目的。這一結(jié)果與有關席夫堿和1，2，3－三氮唑能夠提高化合物抑菌活性的報道相吻合[17－18］。

3 結(jié)論

采用化學方法對菊糖進行結(jié)構(gòu)修飾，通過1，2，3－三氮唑橋連水楊醛類席夫堿于菊糖分子中得到新型三氮唑類菊糖衍生物，其抑菌活性相比于菊糖有明顯提高。該研究不僅為環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)殺菌劑的開發(fā)提供了參考依據(jù)，而且為菊糖的高值化利用開辟了新的領域，有助于推動菊芋的種植開發(fā)，提高鹽堿地的利用率。

[1]WICHIENCHOT S，THAMMARUTWASIK P，JONGJAREONRAK A，et al.Extraction and analysis of prebiotics from selected plants from southern Thailand[J］.Songklanakarin Journal of Science ＆ Technology，2011，33（5）：517－523.

[2]APOLINARIO A C，de LIMA DAMASCENO B P G，de MACEDO BELTRAO N E，et al.Inulin－type fructans：A review on different aspects of biochemical and pharmaceutical technology[J］.Carbohydrate Polymers，2014，101：368－378.

[3]de OLIVEIRA A J B，GONCALVES R A C，CHIERRITO T P C，et al.Structure and degree of polymerisation of fructooligosaccharides present in roots and leaves of Stevia rebaudiana（Bert.）Bertoni[J］.Food Chemistry，2011，129（2）：305－311.

[4]VARSHNEY V K，GUPTA P K，NAITHANI S，et al.Carboxymethylation ofα－cellulose isolated from Lantana camara with respect to degree of substitution and rheological behavior[J］.Carbohydrate Polymers，2006，63（1）：40－45.

[5]YUEN S N，CHOI S M，PHILLIPS D L，et al.Raman and FTIR spectroscopic study of carboxymethylated non－starch polysaccharides[J］.Food Chemistry，2009，114（3）：1091－1098.

[6]JIAO T F，ZHOU J，ZHOU J X，et al.Synthesis and characterization of chitosan－based Schiff base compounds with aromatic substituent groups[J］.Iranian Polymer Journal，2011，20（2）：123－136.

[7]RECK F，ZHOU F，GIRARDOT M，et al.Identification of 4－substituted 1，2，3－triazoles as novel oxazolidinone antibacterial agents with reduced activity against monoamine oxidase A[J］.Journal of Medicinal Chemistry，2005，48（2）：499－506.

[8]ERIKSEN E，MELSEN F，SOD E，et al.Effects of long－term risedronate on bone quality and bone turnover in women with postmenopausal osteoporosis[J］.Bone，2002，31（5）：620－625.

[9]KOLB H C，F(xiàn)INN M，SHARPLESS K B.Click chemistry：Diverse chemical function from a few good reactions[J］.Angewandte Chemie International Edition，2001，40（11）：2004－2021.

[10]張強華，固旭.含鹵席夫堿的合成及抑菌活性觀察[J］.西北藥學雜志，2001，16（6）：284－285.

[11]MA L S，CHEN H X，ZHANG Y，et al.Chemical modification and antioxidant activities of polysaccharide from mushroomInonotus obliquus[J］.Carbohydrate Polymers，2012，89（2）：371－378.

[12]IFUKU S，WADA M，MORIMOTO M，et al.Preparation of highly regioselective chitosan derivatives via“Click Chemistry”[J］.Carbohydrate Polymers，2011，85（3）：653－657.

[13]de RODRIGUEZ D J，HERNANDEZ－CASTILLO D，ANGULOSANCHEZ J.Antifungal activity in vitro of Flourensiaspp.extracts on Alternariasp.，Rhizoctonia solani，and Fusarium oxysporum[J］.Industrial Crops and Products，2007，25（2）：111－116.

[14]REN J，WNAG P，DONG F，et al.Synthesis and antifungal properties of 6－amino－6－deoxyinulin，a kind of precursors for facile chemical modifications of inulin[J］.Carbohydrate Polymers，2012，87（2）：1744－1748.

[15]ZHONG Z M，AOTEGEN B，XU H，et al.Structure and antimicrobial activities of benzoyl phenyl－thiosemicarbazone－chitosans[J］.International Journal of Biological Macromolecules，2012，50（4）：1169－1174.

[16]袁澤利，張欣，吳慶，等.殼聚糖嫁接大環(huán)席夫堿Cu（Ⅱ）配合物的合成及其抗氧活性研究[J］.分子科學學報（中英文版），2013，29（3）：246－250.

[17]KUMAR S，KUMARI M，DUTTA P K，et al.Chitosan biopolymer Schiff base：Preparation，characterization，optical，and antibacterial activity[J］.International Journal of Polymeric Materials，2014，63（4）：173－177.

[18]LV J S，PENG X M，KISHORE B，et al.1，2，3－Triazole－derived naphthalimides as a novel type of potential antimicrobial agents：Synthesis，antimicrobial activity，interaction with calf thymus DNA and human serum albumin[J］.Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters，2014，24（1）：308－313.