格爾德霉素對(duì)SMYD3核轉(zhuǎn)位的影響

齊燕南，邢瑩瑩，奚 濤

（中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京210009）

在基因組中，除了核酸序列本身，還有許多信息可以調(diào)控基因表達(dá)并且可以遺傳給子代，這就是表觀遺傳學(xué)[1］。表觀遺傳學(xué)主要包括DNA甲基化和組蛋白修飾。其中，組蛋白修飾在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。組蛋白修飾包括乙?；?、甲基化、磷酸化、核糖基化、瓜氨酸化、泛素化等6種形式[2］。

SMYD3是一種新發(fā)現(xiàn)的組蛋白甲基化酶，它包含SET和MYND兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)域的“5′－CCCTCC－3′”序列結(jié)合可以上調(diào)下游基因（包括很多原癌基因[3］）的表達(dá)，在腫瘤發(fā)生中有著重要的作用，但SMYD3需要進(jìn)入細(xì)胞核才能發(fā)揮其組蛋白甲基化酶的作用。SMYD3的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)多種癌細(xì)胞的增殖[4－5］，而用 RNAi敲除SMYD3則可以明顯抑制癌細(xì)胞的增殖[6］。羅學(xué)剛等[7］研究表明，SMYD3過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的增殖，而抑制組蛋白修飾將促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[8］，說(shuō)明抑制SMYD3通路有望成為腫瘤治療的新方法。

格爾德霉素（geldanamycin）是一種HSP90特異性的抑制劑。研究表明，HSP90可以與SMYD3形成復(fù)合體促進(jìn)SMYD3在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[4］。

作者在此研究了格爾德霉素對(duì)SMYD3核轉(zhuǎn)位的影響，并探討了SMYD3核轉(zhuǎn)位受到抑制時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

人乳腺癌細(xì)胞株MDA－MB－231，中國(guó)藥科大學(xué)腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)室。

1640、胎牛血清，Gibco公司；胰酶；PBS；二甲基亞砜（DMSO）；MTT；核蛋白提取試劑盒，南京凱基；SMYD3多克隆抗體，自制；β－actin多克隆抗體，Santa Cruz公司；脫脂奶粉；蛋白印記發(fā)光液，Pierce公司；顯影液；定影液；格爾德霉素，上海生工。

RPMI 1640培養(yǎng)基：含10%的胎牛血清、100μg·mL－1的鏈霉素和100U·mL－1的青霉素。

細(xì)胞培養(yǎng)箱，ThermoForma公司；酶標(biāo)儀，BioRad公司；倒置顯微鏡，Leica公司；6孔板、96孔板，Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 Western blot法檢測(cè)SMYD3核轉(zhuǎn)位

將 MDA－MB－231細(xì)胞（在 RPMI 1640培養(yǎng)基中于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)）接種于6孔板中培養(yǎng)至70%融合。將格爾德霉素溶于DMSO，加至6孔板中，使每孔的格爾德霉素終濃度（μmol·L－1）分別為0.03、0.06、0.12、0.24、0.48，繼續(xù)培養(yǎng)24h。將細(xì)胞用胰酶消化，離心，PBS洗2遍，按照核蛋白提取試劑盒說(shuō)明提取核蛋白和胞質(zhì)蛋白。蛋白濃度用BCA法測(cè)定。

取蛋白樣品50μg進(jìn)行電泳（SDS－PAGE）：分離膠為10%，濃縮膠為5%，起始電壓為80V，電泳至分離膠時(shí)調(diào)為120V，繼續(xù)電泳2h。電泳完成后半干式轉(zhuǎn)移到NC膜上。一抗4℃過(guò)夜孵育，二抗室溫1h孵育，用ECL發(fā)光液暗室顯色，考察格爾德霉素對(duì)SMYD3核轉(zhuǎn)位的影響。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè) MDA－MB－231細(xì)胞的增殖

將MDA－MB－231細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種于96孔板，培養(yǎng)至70%融合，加入不同濃度（0.03、0.06、0.12、0.24、0.48，μmol·L－1）格爾德霉素繼續(xù)培養(yǎng)24h，向待測(cè)每孔加入20μL濃度為5mg·mL－1的MTT，37℃繼續(xù)孵育4h，加入150μL的DMSO，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570nm處測(cè)定吸光度（吸光度與細(xì)胞存活數(shù)成正比），考察格爾德霉素對(duì) MDA－MB－231細(xì)胞增殖的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 格爾德霉素對(duì)SMYD3核轉(zhuǎn)位的影響

經(jīng)過(guò)24h不同濃度格爾德霉素處理后，提取MDA－MB－231細(xì)胞的核蛋白和胞質(zhì)蛋白，采用 Western blot法檢測(cè)SMYD3的入核情況，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，隨著格爾德霉素濃度的增大，入核的SMYD3逐漸減少，說(shuō)明格爾德霉素能濃度依賴性地抑制SMYD3的入核。

2.2 格爾德霉素對(duì)MDA－MB－231細(xì)胞增殖的影響（圖2）

由圖2可知，格爾德霉素具有較好的抗腫瘤能力，濃度為0.03mol·L－1時(shí)就對(duì) MDA－MB－231細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。表明格爾德霉素可以通過(guò)抑制SMYD3的核轉(zhuǎn)位抑制MDA－MB－231細(xì)胞的增殖。

圖2 格爾德霉素對(duì)MDA－MB－231細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of geldanamycin on the proliferation of cancer cells MDA－MB－231

3 結(jié)論

采用Western blot檢測(cè)法研究了不同濃度的格爾德霉素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞 MDA－MB－231中SET 和MYND結(jié)構(gòu)域蛋白3（SMYD3）核轉(zhuǎn)位的影響，采用MTT比色法檢測(cè)了格爾德霉素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA－MB－231增殖的影響。結(jié)果表明：格爾德霉素可以抑制SMYD3的核轉(zhuǎn)位，并且這種抑制作用是濃度依賴性的；與對(duì)照組相比，人乳腺癌細(xì)胞 MDA－MB－231的增殖速率被顯著地抑制了。說(shuō)明格爾德霉素可以通過(guò)抑制SMYD3的核轉(zhuǎn)位顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA－MB－231的增殖。

[1]MURRELL A，RAKYAN V K，BECK S.From genome to epigenome[J］.Hum Mol Genet，2005，14（S1）：R3－R10.

[2]KHORASANIZADEH S.The nucleosome：From genomic organization to genomic regulation[J］.Cell，2004，116（3）：259－272.

[3]SIMS R J，REINBERG D.From chromatin to cancer：A new histone lysine methyltransferase enters the mix[J］.Nat Cell Biol，2004，6（8）：685－687.

[4]HAMAMOTO R，F(xiàn)URUKAWA Y，MORITA M，et al.SMYD3 encodes a histone methyltransferase involved in the proliferation of cancer cells[J］.Nat Cell Biol，2004，6（8）：731－740.

[5]HAMAMOTO R，SILVA F P，TSUGE M，et al.Enhanced SMYD3expression is essential for the growth of breast cancer cells[J］.Cancer Sci，2006，97（2）：113－118.

[6]徐鋆耀，陳立波，徐鋆陽(yáng)，等.短發(fā)夾狀RNA抑制SMYD3基因在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)[J］.中華肝臟病雜志，2006，14（2）：105－108.

[7]羅學(xué)剛，林超，陸云華，等.SMYD3與細(xì)胞增殖相關(guān)性及其對(duì)細(xì)胞周期的影響[J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（3）：277－282.

[8]HORING E，PODLECH O，SILKENSTEDT B，et al.The histone deacetylase inhibitor trichostatin a promotes apoptosis and antitumor immunity in glioblastoma cells[J］.Anticancer Res，2013，33（4）：1351－1360.