樹仔菜中多酚物質(zhì)的提取工藝及其清除DPPH的抗氧化作用的研究

范瓊+周聰+趙敏+鄧愛妮+葉海輝+吳瓊

摘 要 為研究樹仔菜中多酚物質(zhì)的提取工藝條件并測定其提取物清除DPPH的抗氧化活性，通過單因素試驗(yàn)，分析不同浸提溶劑、料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度對樹仔菜多酚提取量的影響，通過正交試驗(yàn)確定樹仔菜多酚的最佳提取條件。結(jié)果表明：提取劑為蒸餾水，料液比1∶25，提取溫度30℃，提取時(shí)間8 h。提取條件下，樹仔菜平均多酚提取量達(dá)到17.45 mg/g；80%甲醇樹仔菜提取物對DPPH自由基清除率達(dá)到93.66%，明顯高于BHT。采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化了樹仔菜多酚提取工藝條件，提升了樹仔菜多酚提取量，同時(shí)樹仔菜提取物具有較好的抗氧化作用。

關(guān)鍵詞 樹仔菜 ；多酚類物質(zhì) ；提取工藝 ；抗氧化性

分類號 S636.9

Extraction of Polyphenols from Sauropus androgynus and Its Effect on Radical Scavenging of DPPH

FAN Qiong ZHOU Cong ZHAO Min DENG Aini YE Haihui WU Qiong

（Testing and Analysis Center， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China）

Abstract To evaluate the extraction conditions of polyphenols from Sauropus androgynus （SA） and its anti-oxidative ability， effect of solvent， ratio of solvent-to-solid， extraction time， extraction temperature on the extraction of polyphenols in SA were studied， through orthogonal experiment extraction conditions were optimized. And DPPH radical scavenging ability of SA extracts were evaluated. Results showed the polyphenol content of SA was detected under optimal extraction conditions as followed： extraction solvent of distilled water， solvent-to-solid ratio of 1：25， extraction time of 8h， extraction temperature of 30℃. The content of polyphenol in SA was 17.45mg/g. DPPH radical scavenging ability of 80% methanol extracts from SA showed 93.66%， which was higher than BHT. Conclusion： Through orthogonal experiment optimum conditions for extracting polyphenols from SA were established， and SA extracts showed good DPPH radical scavenging ability.

Keywords Sauropus androgynus ； polyphenols ； extraction ； antioxidation

海南樹仔菜（Sauropus androgynus）為大戟科（Euphorbiaceae）守宮木屬多年生灌木[1]，又名守宮木、天綠香、五指山野菜等，含有豐富的葉綠素、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、微量元素營養(yǎng)成分，其嫩梢味道鮮美、清香脆嫩，具有清熱解毒，消除頭痛，養(yǎng)顏保健，降低血壓等功效[2-5]。樹仔菜作為海南野菜之一具有巨大的潛在價(jià)值，但是目前對樹仔菜的研究多停留在重金屬和毒理學(xué)方面，國內(nèi)外尚未見報(bào)道對該植物的藥理活性基礎(chǔ)等研究[6]。多酚類物質(zhì)是藥理活性基礎(chǔ)的重要指標(biāo)之一，廣泛存在于自然界中，具有抗氧化、抗衰老，抗癌抗菌，降血壓和預(yù)防心腦血管疾病等生理和藥理活性[7-9]，并且安全性高，毒副作用小，因而，在醫(yī)藥及保健食品中的應(yīng)用越來越廣泛[10]。本文對樹仔菜中多酚類物質(zhì)的提取進(jìn)行研究，確定出樹仔菜多酚的最佳提取條件，并測定樹仔菜提取物的抗氧化作用，為有效合理開發(fā)和綜合利用樹仔菜積累重要的科研數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：樹仔菜，采自海南省五指山市樹仔菜基地。

試劑：沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer）純度97.8%；1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）（日本W(wǎng)ako）；乙醇、甲醇、丙酮、Folin-Ciocalteu試劑、無水碳酸鈉均為國產(chǎn)分析純。

儀器：植物粉碎機(jī)，恒溫振蕩器，F(xiàn)D53熱風(fēng)循環(huán)式烘箱（德國Binder賓得公司生產(chǎn)），AE200 型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)），UV-3900 紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司生產(chǎn)），離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 多酚含量的測定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（0.100±0.001）g，用水完全溶解后，轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中定容，配制成濃度為1 000 mg/L 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；吸取5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mL至50 mL容量瓶，定容。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mL，加入40% FC 顯色劑 5 mL，反應(yīng)3～8 min，加入7.5% 碳酸鈉溶液4 mL，混勻，室溫下反應(yīng)1.0 h后，在750 nm 波長下測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=0.001 3x+0.116 4 ，其中y為沒食子酸含量，x為吸光度，R2=0.999 3，具有較好的線性關(guān)系。endprint

提取液中總酚含量的測定：移取0.1 mL提取液，按照測定沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，在750 nm 波長下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樹仔菜總多酚的沒食子酸當(dāng)量。

1.2.2 樹仔菜中多酚提取工藝的確定

多酚的提?。簩渥胁讼磧簦?5℃烘干，過20目篩后存于干燥陰涼處備用。稱取樹仔菜粉末加入溶劑在一定的條件下提取一定時(shí)間后，離心過濾，以相應(yīng)溶劑將濾液定容到一定體積后得到提取液。

1.2.2.1 單因素試驗(yàn)

（1）提取溶劑的選擇：準(zhǔn)確稱取樹仔菜粉末4份，每份10 g，分別加入200 mL蒸餾水、80%乙醇、80%甲醇、80%丙酮提取劑，室溫振蕩12 h，取出后離心過濾，測定各提取液的總多酚含量。

（2）料液比的影響：分別稱取5 g樹仔菜粉末，以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40比例量取蒸餾水，在室溫中振蕩12 h，取出后離心過濾，測定各濾液的總多酚含量。

（3）提取時(shí)間的影響：分別稱取5g樹仔菜粉末，在提取溶劑為蒸餾水，料液比1∶25的條件下，分別提取4、6、8、10、12、24 h，取出后離心過濾，測定各濾液的總多酚含量。

（4）提取溫度的影響：分別稱取5 g樹仔菜粉末，加入125 mL蒸餾水，分別于30、40、50、60、70℃浸提1.0 h，取出后離心過濾，測定各濾液的總多酚含量。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用L9（33）正交試驗(yàn)對料液比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行試驗(yàn)，研究其對樹仔菜多酚提取效果的影響，并對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。其因素水平表見表1。

1.2.3 DPPH自由基清除率的測定

BHT溶液的配制：精確稱取0.100 g BHT，甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，即得濃度為1.0 mg/mL的BHT儲備液。

DPPH自由基清除率的測定：分別吸取2.0 mL提取液和BHT溶液，加入2.0 mL 0.2 g/L DPPH溶液，混勻后在室溫下反應(yīng)30 min，于最大吸收波長517 nm處以水為參比溶液，測定其吸光度，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)，并以式（1）計(jì)算清除率。

清除率（%）=[1-]×100（1）

式中：Ao為2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL樣品溶劑的吸光度；Ai為2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL樣品提取液的吸光度；Aj為蒸餾水與2.0 mL樣品提取液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

根據(jù)1.2.1方法測定多酚，比較4種不同溶劑對樹仔菜多酚提取量的影響結(jié)果（表2）。從表2可以看出，樹仔菜中多酚提取含量與溶劑的極性有關(guān)，溶劑為水時(shí)樹仔菜多酚的提取量最大，其次為80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮。因此，選擇蒸餾水為樹仔菜多酚提取溶劑。

2.2 樹仔菜中多酚提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同料液比的影響

不同料液比對樹仔菜多酚提取的影響見表3。由表3可知，隨著料液比逐漸增大，提取液中的多酚含量逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶25時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大，料液比從1∶25提高至1∶30、1∶40時(shí)，多酚提取量呈下降趨勢。這可能是因?yàn)楫?dāng)料液比為1∶25時(shí)，溶劑對樹仔菜中多酚的提取已經(jīng)基本達(dá)到飽和，料液比的增加并不能顯著提高多酚提取量，因此初步選擇1∶25的料液比作為樹仔菜多酚的提取工藝條件之一。

2.2.2 提取時(shí)間的影響

不同提取時(shí)間對樹仔菜中多酚提取的影響結(jié)果見圖1。由圖1得知，隨著提取時(shí)間的增加，樹仔菜總多酚含量逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間為8 h，樹仔菜的多酚含量為15.6 mg/g，多酚提取量達(dá)到最大。當(dāng)提取時(shí)間進(jìn)一步延長時(shí)，多酚的提取量反而開始減小，這可能與多酚的不穩(wěn)定性有關(guān)。因此初步確定提取時(shí)間范圍為6～12 h。

2.2.3 提取溫度的影響

提取溫度對樹仔菜多酚的提取影響見圖2。

從圖2可以看出，提取溫度在30～60℃時(shí)，樹仔菜多酚的含量變化不是很明顯，提取溫度大于60℃時(shí)，樹仔菜多酚含量顯著下降。當(dāng)提取溫度過高時(shí)，多酚易發(fā)生氧化或降解反應(yīng)導(dǎo)致多酚提取量顯著降低[11]。因此，在樹仔菜的提取工藝中，溫度范圍宜選擇30～60℃。

2.3 提取工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）三個(gè)因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最佳的提取條件，結(jié)果見表4、5。由表4正交試驗(yàn)R中極差可知，各因素對多酚提取量的影響次序?yàn)锳>C>B，得出較優(yōu)試驗(yàn)組合為A2B2C1。但從表5可以看出，F(xiàn)（A）>F0. 05 （2，2）說明料液比（A）的改變對樹仔菜多酚提取量有顯著的影響，而提取時(shí)間（C）和提取溫度（B）對樹仔菜多酚的提取量影響不顯著。因此，從節(jié)約試驗(yàn)成本，降低能量消耗等方面綜合考慮，選擇提取溫度30℃，試驗(yàn)組合A2B1C1，即料液比1∶25，提取溫度30℃，提取時(shí)間8 h為較優(yōu)提取條件。

2.4 樹仔菜中多酚含量的測定

根據(jù)正交試驗(yàn)的最佳提取條件，對樹仔菜中的多酚進(jìn)行了提取和含量測定，平行測定6次，測得樹仔菜中的平均多酚含量為17.45 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%，高于正交試驗(yàn)中的多酚提取量，證明了試驗(yàn)組合A2B1C1提取條件的可行性。

2.5 樹仔菜提取物的DPPH自由基的清除率

準(zhǔn)確稱取樹仔菜粉末4份，每份10 g，分別加入200 mL蒸餾水、80%乙醇、80%甲醇、80%丙酮提取劑，室溫振蕩12 h，取出后離心過濾得樹仔菜提取液，測定4種樹仔菜提取物對DPPH自由基的清除率，結(jié)果見表6。從表6得知，樹仔菜提取物對DPPH自由基清除率從高到低順序?yàn)椋?0%甲醇提取物、80%乙醇提取物、80%丙酮提取物、水提取物。此結(jié)果與表1結(jié)果相比較得知，雖然多酚是評價(jià)植物抗氧化性能力的重要指標(biāo)之一，但是抗氧化性能力并不完全依賴于其多酚含量。這可能與樹仔菜中存在多種綜合性的抗氧化物質(zhì)，其他抗氧化性物質(zhì)更好的溶解于有機(jī)相的溶劑有關(guān)。endprint

3 結(jié)論

本研究以多酚含量作為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化了樹仔菜多酚的提取條件。影響最大的因素是料液比，浸提時(shí)間和浸提溫度的影響相對不明顯，提取樹仔菜多酚物質(zhì)的最佳條件是：蒸餾水作為提取溶劑，料液比為1∶25，提取溫度為30℃，提取時(shí)間為8 h。以該優(yōu)化條件提取時(shí)，多酚粗提物的平均多酚含量為17.45 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%，高于正交試驗(yàn)中的多酚提取量，證明該提取條件有效可行。水、80%甲醇，80%乙醇、80%丙酮不同溶劑的樹仔菜提取物對DPPH自由基清除率分別為80.58%、93.66%、91.78%和89.75%，其有機(jī)溶劑提取的樹仔菜的抗氧化性效果均優(yōu)于BHT，表現(xiàn)出良好的抗氧化性效果。

參考文獻(xiàn)

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3 結(jié)論

本研究以多酚含量作為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化了樹仔菜多酚的提取條件。影響最大的因素是料液比，浸提時(shí)間和浸提溫度的影響相對不明顯，提取樹仔菜多酚物質(zhì)的最佳條件是：蒸餾水作為提取溶劑，料液比為1∶25，提取溫度為30℃，提取時(shí)間為8 h。以該優(yōu)化條件提取時(shí)，多酚粗提物的平均多酚含量為17.45 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%，高于正交試驗(yàn)中的多酚提取量，證明該提取條件有效可行。水、80%甲醇，80%乙醇、80%丙酮不同溶劑的樹仔菜提取物對DPPH自由基清除率分別為80.58%、93.66%、91.78%和89.75%，其有機(jī)溶劑提取的樹仔菜的抗氧化性效果均優(yōu)于BHT，表現(xiàn)出良好的抗氧化性效果。

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3 結(jié)論

本研究以多酚含量作為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化了樹仔菜多酚的提取條件。影響最大的因素是料液比，浸提時(shí)間和浸提溫度的影響相對不明顯，提取樹仔菜多酚物質(zhì)的最佳條件是：蒸餾水作為提取溶劑，料液比為1∶25，提取溫度為30℃，提取時(shí)間為8 h。以該優(yōu)化條件提取時(shí)，多酚粗提物的平均多酚含量為17.45 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%，高于正交試驗(yàn)中的多酚提取量，證明該提取條件有效可行。水、80%甲醇，80%乙醇、80%丙酮不同溶劑的樹仔菜提取物對DPPH自由基清除率分別為80.58%、93.66%、91.78%和89.75%，其有機(jī)溶劑提取的樹仔菜的抗氧化性效果均優(yōu)于BHT，表現(xiàn)出良好的抗氧化性效果。

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