蜻蜓鳳梨葉片組織培養(yǎng)植株再生的研究

符運柳+徐立+李志英+黃碧蘭+李克烈

摘 要 以蜻蜓鳳梨試管苗葉片為外植體進行離體再生研究。結(jié)果表明，葉片誘導(dǎo)直接分化不定芽的最佳培養(yǎng)基是MS+BA 5.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L，分化率高達80%。增殖培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。壯苗培養(yǎng)基為MS+NAA 2.0 mg/L。生根培養(yǎng)基為MS+NAA 2.0 mg/L+AC 0.5 g/L，生根率達100%。

關(guān)鍵詞 蜻蜓鳳梨 ；葉片 ；組織培養(yǎng) ；植株再生

分類號 TP391

Tissue Culture and Plant Regeneration of Aechmea fasciata Leaf

FU Yunliu XU Li LI Zhiying HUANG Bilan LI Kelie

（Institute of Tropical Crop Genetic Resources / Ministry of Agriculture Key Laboratory

of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China & Key Laboratory

of Tropical Crops Germplasm Resources Genetic Improvement and Innovation， CATAS，

Danzhou， Hainan 571737）

Abstract The regeneration system of Aechmea fasciata in vitro was studied with leaves as explants. The results showed the optimal medium for shoots induction was MS+BA 5.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L with the induction frequency of 80%. The shoot multiplying medium was MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L. The elongation medium was MS+NAA 2.0 mg/L. The rooting medium was MS+NAA 2.0 mg/L+AC 0.5 g/L. The rooting frequency was 100%.

Keywords Aechmea fasciata ； leaf ； tissue culture ； plant regeneration

蜻蜓鳳梨（Aechmea fasciata）為鳳梨科光萼荷屬植物，又名粉菠蘿，其觀賞期可達數(shù)月之久，由于花序粉紅美麗，故商品名稱之為“粉佳人”，原產(chǎn)于南美洲熱帶地區(qū)，自20世紀80年代初引入我國。其花形葉貌千姿百態(tài)，是很好的室內(nèi)觀賞植物，觀賞價值和經(jīng)濟效益很高，市場前景廣闊。蜻蜓鳳梨?zhèn)鹘y(tǒng)的繁殖是利用其開花后母株產(chǎn)生的吸芽分株來實現(xiàn)，但由于生長不整齊、繁殖速度慢，后來逐漸被組織培養(yǎng)方法取代。目前我國對蜻蜓鳳梨快速繁殖的研究已經(jīng)起步，但以離體培養(yǎng)為手段進行的變異品種選育、種質(zhì)資源創(chuàng)新等方面的研究有待開展[1]。已經(jīng)報道的蜻蜓鳳梨的離體培養(yǎng)均以其短縮莖[2-3]或試管苗的莖段、莖尖[4]為外植體進行組織培養(yǎng)，以葉片為外植體直接誘導(dǎo)分化芽的研究尚未見報道。蜻蜓鳳梨開花量雖大，但在我國栽培的蜻蜓鳳梨很難結(jié)實。因此，通過雜交培育蜻蜓鳳梨的優(yōu)良品種較難實現(xiàn)。隨著分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)新種質(zhì)在多種植物上獲得了成功[5-10]。盡管蜻蜓鳳梨已經(jīng)頗具觀賞價值，但人們追求新、奇、特的心理使得有必要對蜻蜓鳳梨進行創(chuàng)新。本研究以蜻蜓鳳梨的無菌苗葉片為外植體，建立了高效的植株再生體系，為蜻蜓鳳梨及其他鳳梨科植物的品種改良奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

蜻蜓鳳梨試管苗，來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶品種資源研究所快繁中心。

1.2 方法

1.2.1 叢生芽的誘導(dǎo)

取蜻蜓鳳梨試管苗葉片，從葉基部往上切取3段，每段長約0.5 cm左右，接種于以MS為基本培養(yǎng)基添加不同種類不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生，40 d后統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.2 增殖、壯苗、生根

待叢生芽長到2 cm左右時，轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基上，反復(fù)繼代增殖6代后，轉(zhuǎn)至壯苗培養(yǎng)基上，待苗長到5 cm左右時，單株切下，接種于生根培養(yǎng)基上。

1.3 培養(yǎng)基配方

1.3.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同種類不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑（表2）。

1.3.2 增殖、壯苗培養(yǎng)基

增殖培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；壯苗培養(yǎng)基為MS+NAA 2.0 mg/L。

1.3.3 生根培養(yǎng)基

生根培養(yǎng)基為 MS+NAA 2.0 mg/L+AC 0.5 g/L。

以上培養(yǎng)基均附加3%蔗糖、0.7%瓊脂，pH值5.8～6.0，121℃滅菌20 min。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照時間12 h/d，光照強度30～40 μmol/m2/s。

1.4 統(tǒng)計分析

采用鄧肯氏新復(fù)極差法（SSR）對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜻蜓鳳梨無菌苗葉片不同部位的分化情況

蜻蜓鳳梨試管苗的葉片切段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，10 d后，大部分帶葉基的葉片切段在葉基一端發(fā)生瘤狀突起，20 d后分化出芽（圖1 A，1B）。其中帶葉基的葉片切段分化率高達83.3%，而其他切段則不分化或很難分化，說明葉片的不同部位的分化能力存在極顯著差異（表1）。因此，采用蜻蜓鳳梨的試管苗葉片進行誘導(dǎo)不定芽，以帶葉基的葉片切段做外植體效果較為理想。endprint

2.2 不同激素組合對蜻蜓鳳梨葉片基部誘導(dǎo)分化不定芽的影響

從表2中可以看出，誘導(dǎo)蜻蜓鳳梨葉片產(chǎn)生不定芽較理想的培養(yǎng)基為MS+BA 5.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L，誘導(dǎo)率高達80%。只加IBA時，葉片切口處長根，不能分化出芽。本研究結(jié)果表明，生長素IBA與細胞分裂素6-BA配合使用，對蜻蜓鳳梨葉片誘導(dǎo)不定芽效果明顯，其不定芽分化率高。

2.3 增殖、壯苗與生根

將葉片分化的不定芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基。經(jīng)增殖得到的叢生芽可反復(fù)繼代，其增殖系數(shù)為2～3。增殖約6代后轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基上。當(dāng)不定芽長至5 cm左右時單株切下， 接于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，15 d后便開始發(fā)根，生根率為100%（圖1D）。 約30 d后，待小苗高7 cm左右時即可煉苗移栽。

2.4 煉苗、移栽

參照徐立等[2]的方法，將生根良好的瓶苗打開瓶蓋，室內(nèi)煉苗3 d后，取出小苗，洗干凈根部培養(yǎng)基，移植到育苗盤中。栽培基質(zhì)配比為園田土∶椰糠∶河沙∶牛糞=4∶1∶1∶1。移栽前澆透水，移栽后再澆足定根水，用塑料薄膜和遮陰網(wǎng)進行遮蔭保濕，15 d 后逐漸去掉塑料薄膜并及時澆水，小苗存活率為95%左右。

3 討論與結(jié)論

在蜻蜓鳳梨葉片誘導(dǎo)不定芽的研究中，能直接分化不定芽的基本是葉片的基部，而葉片中部和葉尖很難分化不定芽。葉片不同部位分化不定芽的能力存在明顯差異，這可能與葉基部是葉片的生長部位，其分生組織活躍，或者該部位內(nèi)源激素濃度較易分化成芽有關(guān)，而中部和頂部的葉段為成熟的組織，所含內(nèi)源激素可能不適合分化芽，因此在與基部葉段相同的外源激素水平下較難誘導(dǎo)。

本研究以MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L為增殖培養(yǎng)基，增殖效果較好，但在該培養(yǎng)基上芽比較細弱，不易長高，需轉(zhuǎn)到壯苗培養(yǎng)基MS+NAA 2.0 mg/L上經(jīng)壯苗培養(yǎng)后，再切起單芽進行生根培養(yǎng)獲得完整植株。

參考文獻

[1] 傅新生，孟嬌武，劉 金. 現(xiàn)代花卉[M]. 北京：北京中國青年出版社，2003：75-76.

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[9] 蔣黎明. 菠蘿（臺農(nóng)16號）遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立以及白藜蘆醇合成酶基因轉(zhuǎn)化菠蘿的研究[D]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

[10] Firoozabady E.， Heckert M.， Gutterson N. Transformation and regeneration of pineapple. Plant Cell， Tissue and Organ Culture[J]. 2006（84）： 1-16.endprint

2.2 不同激素組合對蜻蜓鳳梨葉片基部誘導(dǎo)分化不定芽的影響

從表2中可以看出，誘導(dǎo)蜻蜓鳳梨葉片產(chǎn)生不定芽較理想的培養(yǎng)基為MS+BA 5.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L，誘導(dǎo)率高達80%。只加IBA時，葉片切口處長根，不能分化出芽。本研究結(jié)果表明，生長素IBA與細胞分裂素6-BA配合使用，對蜻蜓鳳梨葉片誘導(dǎo)不定芽效果明顯，其不定芽分化率高。

2.3 增殖、壯苗與生根

將葉片分化的不定芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基。經(jīng)增殖得到的叢生芽可反復(fù)繼代，其增殖系數(shù)為2～3。增殖約6代后轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基上。當(dāng)不定芽長至5 cm左右時單株切下， 接于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，15 d后便開始發(fā)根，生根率為100%（圖1D）。 約30 d后，待小苗高7 cm左右時即可煉苗移栽。

2.4 煉苗、移栽

參照徐立等[2]的方法，將生根良好的瓶苗打開瓶蓋，室內(nèi)煉苗3 d后，取出小苗，洗干凈根部培養(yǎng)基，移植到育苗盤中。栽培基質(zhì)配比為園田土∶椰糠∶河沙∶牛糞=4∶1∶1∶1。移栽前澆透水，移栽后再澆足定根水，用塑料薄膜和遮陰網(wǎng)進行遮蔭保濕，15 d 后逐漸去掉塑料薄膜并及時澆水，小苗存活率為95%左右。

3 討論與結(jié)論

在蜻蜓鳳梨葉片誘導(dǎo)不定芽的研究中，能直接分化不定芽的基本是葉片的基部，而葉片中部和葉尖很難分化不定芽。葉片不同部位分化不定芽的能力存在明顯差異，這可能與葉基部是葉片的生長部位，其分生組織活躍，或者該部位內(nèi)源激素濃度較易分化成芽有關(guān)，而中部和頂部的葉段為成熟的組織，所含內(nèi)源激素可能不適合分化芽，因此在與基部葉段相同的外源激素水平下較難誘導(dǎo)。

本研究以MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L為增殖培養(yǎng)基，增殖效果較好，但在該培養(yǎng)基上芽比較細弱，不易長高，需轉(zhuǎn)到壯苗培養(yǎng)基MS+NAA 2.0 mg/L上經(jīng)壯苗培養(yǎng)后，再切起單芽進行生根培養(yǎng)獲得完整植株。

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[9] 蔣黎明. 菠蘿（臺農(nóng)16號）遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立以及白藜蘆醇合成酶基因轉(zhuǎn)化菠蘿的研究[D]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

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2.2 不同激素組合對蜻蜓鳳梨葉片基部誘導(dǎo)分化不定芽的影響

從表2中可以看出，誘導(dǎo)蜻蜓鳳梨葉片產(chǎn)生不定芽較理想的培養(yǎng)基為MS+BA 5.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L，誘導(dǎo)率高達80%。只加IBA時，葉片切口處長根，不能分化出芽。本研究結(jié)果表明，生長素IBA與細胞分裂素6-BA配合使用，對蜻蜓鳳梨葉片誘導(dǎo)不定芽效果明顯，其不定芽分化率高。

2.3 增殖、壯苗與生根

將葉片分化的不定芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基。經(jīng)增殖得到的叢生芽可反復(fù)繼代，其增殖系數(shù)為2～3。增殖約6代后轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基上。當(dāng)不定芽長至5 cm左右時單株切下， 接于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，15 d后便開始發(fā)根，生根率為100%（圖1D）。 約30 d后，待小苗高7 cm左右時即可煉苗移栽。

2.4 煉苗、移栽

參照徐立等[2]的方法，將生根良好的瓶苗打開瓶蓋，室內(nèi)煉苗3 d后，取出小苗，洗干凈根部培養(yǎng)基，移植到育苗盤中。栽培基質(zhì)配比為園田土∶椰糠∶河沙∶牛糞=4∶1∶1∶1。移栽前澆透水，移栽后再澆足定根水，用塑料薄膜和遮陰網(wǎng)進行遮蔭保濕，15 d 后逐漸去掉塑料薄膜并及時澆水，小苗存活率為95%左右。

3 討論與結(jié)論

在蜻蜓鳳梨葉片誘導(dǎo)不定芽的研究中，能直接分化不定芽的基本是葉片的基部，而葉片中部和葉尖很難分化不定芽。葉片不同部位分化不定芽的能力存在明顯差異，這可能與葉基部是葉片的生長部位，其分生組織活躍，或者該部位內(nèi)源激素濃度較易分化成芽有關(guān)，而中部和頂部的葉段為成熟的組織，所含內(nèi)源激素可能不適合分化芽，因此在與基部葉段相同的外源激素水平下較難誘導(dǎo)。

本研究以MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L為增殖培養(yǎng)基，增殖效果較好，但在該培養(yǎng)基上芽比較細弱，不易長高，需轉(zhuǎn)到壯苗培養(yǎng)基MS+NAA 2.0 mg/L上經(jīng)壯苗培養(yǎng)后，再切起單芽進行生根培養(yǎng)獲得完整植株。

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[9] 蔣黎明. 菠蘿（臺農(nóng)16號）遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立以及白藜蘆醇合成酶基因轉(zhuǎn)化菠蘿的研究[D]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

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