瀕危植物延齡草初代培養(yǎng)中無菌培養(yǎng)物的建立

李 群, 王 麗

（1.四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都610101； 2.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都610064）

延齡草（Trillium tschonoskii Maxim）,俗名頭頂一顆珠,為百合科多年生草本植物,主要分布在中國及日本［1］,生長在海拔1 600～3 200 m的陰濕環(huán)境里.根莖含薯蕷皂苷,葉片含黃酮類化合物等有效成份,具殺菌、止血、解毒等功效,主治頭暈?zāi)垦?、高血壓、神?jīng)衰弱癥,是傳統(tǒng)名貴中藥之一［2-3］.近年來,由于生長環(huán)境惡化和過度采挖,加之延齡草種子休眠期長、發(fā)芽率低等生物學(xué)特性,導(dǎo)致種群數(shù)量急劇下降,已被國家列為三級保護植物［4］.為了拯救資源,近年來一些單位對其進行遷地保護栽培研究,但由于延齡草對環(huán)境條件要求較為特殊,異地栽培繁殖亦相當(dāng)困難.采用離體培養(yǎng)快速繁殖來挽救其種質(zhì)資源是較為理想的方法.離體快繁中關(guān)鍵步驟之一是建立無菌培養(yǎng)物.本文擬對延齡草離體培養(yǎng)中初代培養(yǎng)物進行微生物分離與鑒定,采用抗生素抑制微生物生長,旨在獲得大量無菌培養(yǎng)物.該研究為延齡草離體繁殖奠定了基礎(chǔ).

<1)，且各件產(chǎn)品是否為不合格品相互獨立．

1 材料和方法

1.1 植物材料本研究實驗材料采自峨眉山雷洞坪（海拔2 750 m）.將延齡草植株根和根莖以上部分去掉,用毛筆刷凈根莖上的棕褐色物質(zhì),用流水沖洗24 h.取出根莖,用5 g/L洗衣粉水浸泡30 min,用蒸餾水清洗后,放入超凈工作臺上的無菌廣口瓶中,用體積分數(shù)75%的乙醇浸泡30 s,無菌水沖洗1次,再用質(zhì)量分數(shù)0.1%的升汞消毒8 min,無菌水沖洗4次,每次停留3 min.將消毒后的實驗材料用無菌濾紙吸干水分,切成0.5 cm3大小后接種,培養(yǎng)基為MS［5］,不添加任何激素.然后將接種材料放在20℃、2 000 Lx光照條件下,每天進行16 h光照培養(yǎng).15 d后觀察外植體污染情況.

1.2 菌種的分離純化挑取植物組織上的微生物作為分離純化和鑒定的菌種材料.具體方法如下:用接種環(huán)挑取植物組織上的微生物,接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上［6］,37℃倒置培養(yǎng),直至長出菌斑,分別挑取不同形態(tài)特征的菌落,劃線于牛肉膏蛋白胨平板上進行分離,挑選典型單菌落,反復(fù)純化,直到菌落形態(tài)一致,在顯微鏡下觀察無顯著差別為止.

1.3 菌種的形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定根據(jù)文獻［6-7］的方法進行.生理生化測試項目見表1.

1.4 對污染材料進行抑菌處理

1.4.1 在培養(yǎng)基中添加抗生素 在菌種鑒定基礎(chǔ)上,選擇幾種抗生素按質(zhì)量濃度梯度加入培養(yǎng)基中（見表2）,培養(yǎng)基激素組合為MS+6-芐基嘌呤（BA）2.0 mg/L+吲哚酸乙酸（IAA）1.0 mg/L.然后將外植體接種到培養(yǎng)基上,20 d后觀察外植體的污染情況.

表1 延齡草初代培養(yǎng)物感染菌種的生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Results of the biochemical and physiological identification of the infected bacterium of the initiation culture of Trillium tschonoskii Maxim

表2 培養(yǎng)基中添加不同種類、質(zhì)量濃度抗生素的抑菌效果Table 2 Effects of antibacteria by the supplementation of different antibiotic in different concentration into the medium

表3 不同種類、質(zhì)量濃度抗生素溶液處理污染外植體的效果Table 3 Effects of different kinds and concentration antibiotic solution treatment to explants contamination

1.4.2 對污染材料直接進行浸泡處理 接種初期,觀察到外植體或培養(yǎng)基出現(xiàn)粘液狀或泡沫發(fā)酵狀物質(zhì)或真菌菌絲時（污染特別嚴重的應(yīng)丟棄）,將外植體取出,用無菌水清洗,抗生素溶液中浸泡并置于恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)（120 r/min）6 h（見表3）,之后再接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng).20 d后觀察材料污染及萌動情況.

2 結(jié)果

2.1 植物材料中菌株的獲得接種半個月后的植物材料經(jīng)觀察,發(fā)現(xiàn)98%以上的植物組織都被微生物感染且材料很少萌動.外植體周圍感染紅色粘狀微生物,從植物組織蔓延至培養(yǎng)基中,污染嚴重時使培養(yǎng)基發(fā)黃且組織褐變致死.觀察中還發(fā)現(xiàn),微生物在培養(yǎng)基上生長緩慢,1～2月沒有明顯的生長和繁殖.植物材料表現(xiàn)出一種慢性感染的狀態(tài).多次試驗結(jié)果都如此.從感染的植物組織中分離純化獲得2株形態(tài)單一的菌株,分別命名為TM001和TM002.

2.2 菌種的形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.1 群體特征 以伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB）為培養(yǎng)基［6］,37 ℃培養(yǎng).“TM001”菌株和“TM002”菌株及對照的大腸桿菌12 h菌齡時為粉紅色,24 h之后菌苔邊緣粉紅色,中間已變成紫色,菌苔常較粘稠.

2.2.2 個體特征 取“TM001”菌株和“TM002”菌株用呂氏美藍單染色,鏡檢,菌體形態(tài)均一.各測20個菌體計算平均值:長 0.5 μ m,寬 ＜0.5 μ m.

2.2.3 革蘭氏染色 以3點平行法涂片,以大腸桿菌（G-）和枯草桿菌（G+）為對照,結(jié)果顯示2株菌均為G-球桿菌.

2.2.4 芽孢染色 經(jīng)芽孢生成培養(yǎng)基培養(yǎng)均無芽孢生成.

2.3 菌種的生理生化鑒定根據(jù)以上各項實驗結(jié)果,待定菌株均屬于腸桿菌科,且“TM001”菌株和“TM002”菌株生理生化實驗參數(shù)完全一致,兩者應(yīng)屬于同一屬.進一步結(jié)合文獻資料［7］得出:它們應(yīng)屬于埃希氏菌屬（Escherichia）.只是待定菌株在產(chǎn)生吲哚的實驗中與對照大腸桿菌的結(jié)果不同,用振蕩和不振蕩2種培養(yǎng)方法進行了多次實驗,結(jié)果均呈陽性反應(yīng).

2.4 對污染材料進行抑菌處理

2.4.1 在培養(yǎng)基中加抗生素 在培養(yǎng)基中加抗生素結(jié)果見表2（表2和表3中,每個處理20支,重復(fù)3次.“+”表示抑菌效果差（大部分外植體被微生物感染,外植體生長狀態(tài)差,外植體未萌動）；“++”表示抑菌效果較好（少部分外植體被微生物感染,外植體生長狀態(tài)一般,外植體有萌動跡象）；“+++”表示抑菌效果最好（大部分外植體未被微生物感染,外植體生長狀態(tài)良好,部分外植體萌動））.

從表2可以得出,鏈霉素在培養(yǎng)基中的抑菌效果最好,在質(zhì)量濃度為200和300 mg/L時都達到了很好的抑菌效果.且在觀察中發(fā)現(xiàn),即使質(zhì)量濃度高達300 mg/L時,外植體生長狀態(tài)仍較好,僅發(fā)現(xiàn)極少外植體輕微褐變,且少部分外植體已開始萌動；其次,α-氨芐青霉素的抑菌效果也不錯,外植體損傷較小,且有萌動趨勢；而慶大霉素抑菌效果最差,外植體帶菌較多并表現(xiàn)出較差的生長狀態(tài),組織看起來處于一種失水狀態(tài),褐變也較為嚴重,幾乎沒萌動.

2.4.2 對污染材料直接進行抗菌處理 抗菌處理結(jié)果見表3.

從表3可看出,不同質(zhì)量濃度的抗生素處理均可獲得一定的抑菌效果,以100 mg/L的鏈霉素和150 mg/L的α-氨芐青霉素效果最好,而50和150 mg/L的慶大霉素、150 mg/L的鏈霉素效果最差.可見,在高質(zhì)量濃度（150 mg/L）時,慶大霉素和鏈霉素的抑菌效果反而較差,這可能是由于抗生素對材料的副作用太大,導(dǎo)致材料的抵抗力降低所致.據(jù)報道,抗生素對植物材料的副作用主要是對植物細胞產(chǎn)生毒性,甚至殺死植物細胞［8-9］.這種毒性導(dǎo)致植物材料抵抗所感染微生物的能力減弱.除此之外,在觀察中還發(fā)現(xiàn),所有生長狀態(tài)較好的外植體都有萌動趨勢,污染的外植體都有輕微的褐變,并處于一種輕微失水狀態(tài).

3 討論

從最初對外植體的培養(yǎng)中觀察到,外植體污染是植物組織自身帶菌所致.眾所周知,在植物組織培養(yǎng)研究中,相對于操作污染和環(huán)境條件污染,外植體自身帶菌污染是不易控制和消除的［10］,況且對延齡草這種長期生長在高寒地帶的植物來說,帶菌情況復(fù)雜,可用來離體培養(yǎng)的組織器官少.因此,在離體培養(yǎng)中能有效控制和消除外植體自身帶菌造成的污染顯得尤為重要.據(jù)文獻報道,控制外植體自身帶菌污染最有效的措施是對所感染微生物進行分離鑒定,選擇有效的抑菌劑,抑制微生物的生長,同時兼顧外植體的生長狀態(tài),最終達到既控制微生物生長,又不影響材料生長繁殖的目的［11-12］.如 P.M.Young 等［13］在蘋果和杜鵑的污染莖段組培苗中加入25 mg/L頭孢霉素、25 mg/L四環(huán)素、6 mg/L利福平和6 mg/L多粘菌素B的混合物后,可培養(yǎng)細菌被完全去除；B.M.Reed等［14］研究發(fā)現(xiàn)1 000 mg/L鏈霉素處理薄荷組培苗10 d后去除內(nèi)生細菌效果最為顯著.盧躍敏等［15］研究表明,將青霉素和慶大霉素以30或15 mg/L的質(zhì)量濃度加入鹽樺培養(yǎng)基中,對抑制污染菌的生長有一定作用,同時可促進鹽樺萌芽和生長.楊元等［16］研究表明,將慶大霉素作為竹芋組織培養(yǎng)中的抑菌劑效果最好,使用質(zhì)量濃度范圍控制在500～1 000 mg/L.綜合大多文獻資料,常用的抑菌劑主要為頭孢霉素、利福平、慶大霉素、鏈霉素、α-氨芐青霉素等抗生素.因此,本研究也首先考慮使用其中的幾種抗生素.

本研究對感染的微生物進行了形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定,結(jié)果表明感染的菌株均屬于腸桿菌科埃希氏菌屬.選用3種單一的抑菌劑來抑菌,結(jié)果表明,無論是在培養(yǎng)基中直接加抑菌劑還是用抑菌劑溶液直接浸泡外植體,只要選擇好有效的抑菌劑種類、適宜的處理質(zhì)量濃度、恰當(dāng)?shù)奶幚頃r間,都能獲得較好的抑菌效果.本研究在培養(yǎng)基中加200 mg/L鏈霉素或300 mg/L α-氨芐青霉素能獲得較好的抑菌效果；用100 mg/L鏈霉素或150 mg/L α-氨芐青霉素浸泡污染外植體6 h也能獲得較好的抑菌效果.在后期培養(yǎng)中是否還繼續(xù)使用抑菌劑及抑菌劑對材料的影響,還有待進一步觀察研究.

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