三聚氰胺分子印跡聚合物的合成與識別機理研究

方盧秋, 歐文林

（長江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,重慶 涪陵408100）

1 預(yù)備知識

近年來,發(fā)生在國內(nèi)嬰幼兒奶粉受三聚氰胺污染導(dǎo)致嬰幼兒腎結(jié)石事件以及在美國發(fā)生多起飼料致死寵物事件,使三聚氰胺成為國內(nèi)外公眾關(guān)注的熱點［1-2］.三聚氰胺（Melamine,簡寫為 Mel,化學(xué)式為C3H6N6）,學(xué)名三氨三嗪,俗稱蜜胺、蛋白精,是一種三嗪類含氮雜環(huán)的有機化合物；主要用于制造三聚氰胺甲醛樹脂,普遍存在于塑料、涂料等材料中.微溶于水,可溶于甲醇、甲醛、熱乙二醇、甘油、吡啶等,不溶于丙酮、醚類［3］.因食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量測定大多采用總氮測定的方法,而三聚氰胺含氮量高達66%左右［4］,常被非法添加到食品和飼料中以提高蛋白質(zhì)的含量指標(biāo),給消費者健康帶來危害.

目前,國內(nèi)外檢測食品及飼料中三聚氰胺殘留,通常采用液相色譜法［5］、氣相色譜 -質(zhì)譜法［6］、液相色譜 -質(zhì)譜法［7］、毛細管電泳技術(shù)等［8］,這些方法成本較高,在檢測前都需要進行復(fù)雜的樣品預(yù)處理,如對樣品進行液-液萃取后,采用多步柱凈化和富集.

分子印跡技術(shù)是近幾十年來發(fā)展起來的一種包含多種學(xué)科的研究方法.分子印跡聚合物（MIP）對目標(biāo)分子具有高度的選擇性,且性能穩(wěn)定、價格低廉,可以解決樣品前處理復(fù)雜、成本較高等問題,至今已被用于傳感器、色譜分離、固相萃取和人工抗體等領(lǐng)域［9-10］.為了選擇性地富集分離與特異性地分子識別三聚氰胺,人們研究合成了幾種三聚氰胺分子印跡聚合物［11-13］.

本研究以三聚氰胺為模板分子,優(yōu)化選擇了溶劑；以丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸、鄰氨基酚、甲基丙烯酸甲酯為功能單體進行選擇實驗；以二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑,以偶氮二異丁腈為引發(fā)劑,分別進行本體聚合法和沉淀聚合法制備MIP和NIP（不含模板分子的空白分子印跡聚合物）,選擇較優(yōu)的制備方法；并對三聚氰胺分子印跡聚合物的分子識別機理進行實驗研究.

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器丙烯酸（簡寫為AA,成都市科龍化工試劑廠）；a-甲基丙烯酸（簡寫為MAA,成都市科龍化工試劑廠）；甲基丙烯酸甲酯（簡寫為MMA,成都市科龍化工試劑廠）；丙烯酰胺（簡寫為AM,成都市科龍化工試劑廠）；鄰氨基酚（簡寫為OAP,五聯(lián)化工廠）；二甲基丙烯酸乙二醇酯（簡寫為EGDMA,東京化成工業(yè)株式會社）；偶氮二異丁腈（簡寫為AIBN,成都市科龍化工試劑廠）；三聚氰胺（成都科龍化工試劑廠）；甲醇（簡寫為Met,色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠）；乙腈（色譜純,天津市光復(fù)精細化工研究所）；冰醋酸（成都市科龍化工試劑廠）；高純氮氣；以上化學(xué)試劑均為分析純,實驗中所使用的水均為超純水.

AA、MAA、MMA、AM、EGDMA、AIBN 使用前精制方法如下所述.

丙烯酸的精制:移取50 mL AA,加10.0 g活性炭顆粒,振蕩30 min,干過濾后置于4℃冰箱中保存.

α-甲基丙烯酸的精制:移取50 mL MAA,加入10.0 g活性炭顆粒,振蕩30 min后干過濾,置于4℃恒溫箱中保存.

甲基丙烯酸甲酯的精制:在500 mL分液漏斗中加入250 mL甲基丙烯酸甲酯,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaOH溶液洗滌至無色.用超純水洗滌至中性后,再用無水硫酸鈉干燥一周,減壓蒸餾,餾出液于恒溫箱中4℃密封冷藏.

丙烯酰胺的精制:稱50 g丙烯酰胺溶于40℃的20 mL超純水中,置冰箱冷卻結(jié)晶,用布氏漏斗過濾,自然晾干,在20～30℃下真空干燥24 h,保存于恒溫箱中.

二甲基丙烯酸乙二醇酯的精制:取50 mL EGDMA加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%NaOH溶液20 mL于分液漏斗中,用NaOH溶液分3次洗滌,再加入無水CaCl230 g,干過濾得精制品.

偶氮二異丁腈的精制:取質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%乙醇50 mL加入磨口錐形瓶中,回流加熱至沸騰,加入5 g偶氮二異丁腈,振蕩至AIBN溶解,抽濾熱溶液,在4℃下冷卻結(jié)晶后,在干燥器中干燥,成品保存于棕色試劑瓶中.

超聲波清洗機（SB-5200D型,寧波新芝生物科技股份有限公司）；電子天平（EL104型,梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；調(diào)速振蕩器（HY-8型,常州國華電器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6型,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；紫外可見分光光度計（U-3010型,日本日立公司）；振蕩混合器（S25型,德國IKA公司）；光照培養(yǎng)箱（YSEI型,重慶市永生實驗儀器廠）.

2.2 實驗方法

2.2.1 溶劑的選擇實驗 準(zhǔn)確稱取25 mg（為0.198 2 mmol）三聚氰胺于10 mL比色管中,分別加入用于分子印跡聚合物合成的常見溶劑5.0 mL,在調(diào)速振蕩器上振蕩2 h.以三聚氰胺的溶解速度相對較快和溶解數(shù)量較多為選擇依據(jù),確定所要選定的溶劑.

2.2.2 功能單體的選擇實驗 準(zhǔn)確稱取25 mg三聚氰胺于10 mL比色管中,按照三聚氰胺∶功能單體的物質(zhì)的量比為1∶4的比例加入功能單體,再分別加入選定的溶劑5.0 mL.將混合液超聲振蕩30 min,室溫下靜置24 h后,移取0.1 mL混合液,用相應(yīng)溶劑稀釋至10 mL,以選定的溶劑為參比,在波長為200～400 nm范圍內(nèi)進行紫外吸收光譜掃描.

2.2.3 三聚氰胺分子印跡聚合物的制備 三聚氰胺分子印跡聚合物的合成采用本體聚合法與沉淀聚合法,制備對應(yīng)的MIP和NIP.

1）本體聚合法.稱取25 mg三聚氰胺于25 mL干燥的比色管中,加入10 mL優(yōu)化選定的溶劑.按照三聚氰胺∶功能單體∶交聯(lián)劑為1∶4∶20的物質(zhì)的量比,加入功能單體和交聯(lián)劑.首先加入功能單體后,超聲波振蕩30 min,在光照培養(yǎng)箱中恒溫4℃預(yù)聚合24 h,再加入交聯(lián)劑EGDMA和50 mg引發(fā)劑AIBN,超聲波振蕩15 min,通入純氮除氧5 min,密封后于60℃恒溫水浴下熱聚合12 h.NIP除不加入Mel外,均按上述步驟操作.制備MIP和NIP各平行2次.將制備好的MIP與NIP于索氏提取器中除去未聚合的模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑和溶劑,以甲醇∶乙酸（體積比為9∶1）為模板分子洗脫劑,索氏提取8 h,用甲醇反復(fù)洗滌分子印跡聚合物以除去殘留的乙酸,于80℃恒溫干燥8 h后待用.

2）沉淀聚合法.稱取25 mg三聚氰胺于100 mL干燥的碘量瓶中,加入10 mL優(yōu)化選定的溶劑,再加入40 mL乙腈.其它操作同本體聚合法.

3）分子印跡聚合物的產(chǎn)率計算.用電子天平準(zhǔn)確稱量制得的分子印跡聚合物,分別按照下式計算分子印跡聚合物MIP與NIP的產(chǎn)率.

2.2.4 三聚氰胺與功能單體的結(jié)合實驗 準(zhǔn)確稱取25 mg三聚氰胺于10 mL比色管中,按照功能單體∶三聚氰胺的物質(zhì)的量比分別為0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1的比例加入選定的功能單體,再分別加入選定的溶劑5.0 mL.將混合液超聲振蕩30 min,室溫下靜置24 h后,移取0.1 mL混合液,用相應(yīng)溶劑稀釋至10 mL,以選定的溶劑為參比,在波長為200～400 nm內(nèi)進行紫外光譜掃描.

3 結(jié)果與討論

3.1 溶劑的選擇三聚氰胺屬于三嗪類雜環(huán)化合物,呈弱堿性,在常見的有機溶劑中溶解度較小.三聚氰胺難溶于氯仿、丙酮等低極性溶劑,文獻資料表明在甲醇中溶解性能較二甲基甲酰胺、二甲基亞砜等要好［14］,以甲醇為溶劑可避免溶劑與三聚氰胺間形成的氫鍵,干擾單體與三聚氰胺的結(jié)合.以二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、水為溶劑進行溶解性對比實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三聚氰胺在甲醇為溶劑中的溶解度較大,可以達到5.0 g/L,溶解速度較快,能滿足分子印跡過程對模板分子溶解度的要求.實驗選擇甲醇為分子印跡聚合物制備過程中的溶劑和致孔劑.

3.2 功能單體的選擇采用紫外光譜法比較模板分子三聚氰胺與 AA、AM、MAA、OPA、MMA 5種功能單體相互結(jié)合的紫外吸光度,數(shù)據(jù)表明:三聚氰胺與AM有最大的紫外吸光度差值（見表1）.

表1 三聚氰胺與功能單體結(jié)合的紫外吸光度Table 1 UV adsorption degree between Mel and different functional monomers

分析Mel與AM相互作用的紫外吸收光譜圖,可以得知:三聚氰胺的最大吸收峰在222 nm處,功能單體的最大紫外吸收波長在230 nm,丙烯酰胺與三聚氰胺的最大紫外吸收波長相接近.丙烯酰胺與三聚氰胺混合后的紫外光譜掃描曲線表明,最大紫外吸收波長在236 nm,紫外吸光度與混合前相比較發(fā)生了很大改變.Mel-AM-Met的紫外吸光度遠大于AM-Met與Mel-Met紫外光譜相疊加的紫外吸光度,表明2種溶液混合后的紫外吸光度不是兩者的簡單疊加,而是2種溶液經(jīng)分子間的自組裝作用形成了新物質(zhì)分子的紫外光譜.

功能單體與模板分子間,當(dāng)兩者最大紫外吸光度相差越大,說明功能單體與模板分子的作用越強［15-16］,從表 1 中可以得出,與 AA、MAA、OPA、MMA相比較,丙烯酰胺與三聚氰胺的相互作用更強,用于合成三聚氰胺分子印跡聚合物,理論上分析AM是較為理想的功能單體.所以,實驗選擇AM為合適的功能單體.

3.3 分子印跡聚合物的產(chǎn)率計算以選擇的溶劑和功能單體,交聯(lián)劑選擇二甲基丙烯酸乙二醇酯,引發(fā)劑選擇偶氮二異丁腈,合成了三聚氰胺分子印跡聚合物,其產(chǎn)率計算見表2.

從表2可以得出,本體聚合法的分子印跡聚合物產(chǎn)率普遍高于沉淀聚合法.沉淀聚合法的MIP與NIP分子印跡聚合物產(chǎn)率的平均值分別為57.48%和58.85%,本體聚合法的MIP與NIP產(chǎn)率平均值分別為91.35%和92.71%.但是本體聚合制得大塊狀分子印跡聚合物,需要經(jīng)過粉碎、研磨、篩分、反復(fù)沉降處理制得一定顆粒直徑的粉末材料,過程繁瑣,得率較低,所以一般采用沉淀聚合法制備分子印跡聚合物.2種聚合法所得到的MIP聚合物產(chǎn)率的平均值都略低于NIP,從分子印跡聚合物合成上分析,可能是聚合物經(jīng)過索氏提取洗滌時間充分,將MIP中游離的Mel、AM等完全洗脫去除有關(guān).

表2 三聚氰胺分子印跡聚合物的產(chǎn)率計算Table 2 The calculation of productive rate for MIP and NIP of Mel

表3 三聚氰胺與丙烯酰胺的分子結(jié)合比例研究數(shù)據(jù)Table 3 The recognition mechanism data between Mel and AM molecules

表4 三聚氰胺與丙烯酰胺的分子結(jié)合比例與結(jié)合常數(shù)Table 4 The molecular binding ratio and constant between Mel and AM molecules

3.4 三聚氰胺與功能單體的結(jié)合模板分子三聚氰胺與功能單體丙烯酰胺的結(jié)合機理通過差示紫外光譜進行研究,可以得知三聚氰胺與丙烯酰胺的分子結(jié)合比例以及分子間反應(yīng)的結(jié)合常數(shù).由于AM的濃度b0即［AM］,遠大于三聚氰胺的濃度a0,根據(jù)文獻［17］,Mel與AM的結(jié)合反應(yīng)公式可推導(dǎo)和整理得如下表達式:△A＝-K△A+K△ξcla0,式中△A為差示吸光度；K表示Mel與AM結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)；△ξcla0為結(jié)合物的組成；n為Mel與AM的分子結(jié)合比例,取正整數(shù).

用表3中的數(shù)據(jù)以對 Δ A作圖,得到圖1、圖2和表4.結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)n＝3時,其回歸方程為＝-492 780△A+374 290 R＝0.910 6,可得到＝-K△A+K△ξcla0.式中的擬合斜率k和結(jié)合常數(shù)K的絕對值都為4.93×105,三聚氰胺與丙烯酰胺主要以氫鍵結(jié)合,三聚氰胺與丙烯酰胺的分子結(jié)合比例為1∶3.n＝4時,可由圖2求得擬合斜率k和結(jié)合常數(shù)K的絕對值都為1.0×108,雖然結(jié)合常數(shù)K值較大,但從分子結(jié)構(gòu)上進行分析,三聚氰胺分子結(jié)構(gòu)中—NH2上N—H鍵的H可與丙烯酰胺中的氨基氮和羰基氧以氫鍵結(jié)合,形成3個很穩(wěn)定的6元環(huán),如圖3所示.

從分子結(jié)構(gòu)上看這種結(jié)合方式最為穩(wěn)定,可推測三聚氰胺和丙烯酰胺之間通過氫鍵形成了1∶3型的結(jié)合物.以分子結(jié)合比例研究和分子結(jié)構(gòu)分析2種方法均得到三聚氰胺與丙烯酰胺之間分子結(jié)合比例都為1∶3的結(jié)論,正是三聚氰胺在其分子印跡聚合物中的選擇性分子識別機理.

4 結(jié)論

以三聚氰胺為模板分子,實驗選擇甲醇作為溶劑和致孔劑、丙烯酰胺作為功能單體.采用沉淀聚合法和本體聚合法制備了三聚氰胺分子印跡聚合物,本體聚合法制備所得MIP與NIP聚合物產(chǎn)率的平均值高于沉淀聚合法,但沉淀聚合法制備的分子印跡聚合物易分離,無須碾磨過篩,吸附性能較好,因此,選擇沉淀聚合法為較優(yōu)合成方法.三聚氰胺與丙烯酰胺之間主要以氫鍵形成1∶3型結(jié)合物,產(chǎn)生特異性的選擇性分子識別,結(jié)合常數(shù)K達到4.93×105,表明分子印跡聚合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定.

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