新生鼠肺成纖維細胞原代培養(yǎng)方法的比較與體外肌成纖維細胞分化模型的建立

孫 月，徐 洪，徐丁潔，魏中秋，于婉瑩，鄧海靜，薛新新，杜世璞，楊 方

0 引 言

矽肺是我國最嚴重的職業(yè)病，對矽肺發(fā)生、發(fā)展和防治機制研究一直是職業(yè)病防治研究領(lǐng)域的重點和熱點課題。在致肺纖維化(包括矽肺纖維化)各種刺激因素的作用下，肺間質(zhì)FB的增殖與合成大量的細胞外基質(zhì)(包括膠原蛋白)是肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而體外培養(yǎng)FB是研究肺纖維化發(fā)生機制和防治手段的必要基礎(chǔ)。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，肌FB分化與器官纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1－2］。由于其細胞質(zhì)內(nèi)有大量平行排列的肌絲而具有較強的收縮和遷移能力，富含細胞器(如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基氏器和糖原顆粒等)而具有活躍的合成、分泌細胞外基質(zhì)功能，故被認為是器官纖維化形成過程中產(chǎn)生過量細胞外基質(zhì)的最主要和最重要的細胞之一［1－2］。本研究擬采用胰蛋白酶消化法和組織塊貼壁法2種不同的原代培養(yǎng)方法，分別進行新生乳鼠FB的培養(yǎng)，觀察并分析采用不同培養(yǎng)方法的優(yōu)缺點，探討新生乳鼠肺FB原代培養(yǎng)的最佳方法;并采用TGF-β1誘導(dǎo)肺 FB向肌FB分化，為建立體外肌FB分化模型、更好地研究矽肺纖維化提供進一步的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SRF級SD大鼠雌雄各2只(北京華阜康公司，許可證號:SCXK京20090004)，6～8周齡，體重160～180g，自由交配，于河北聯(lián)合大學(xué)動物中心屏障動物實驗室飼養(yǎng)，室溫27℃、相對濕度60%。取3 d之內(nèi)新生鼠肺組織進行原代FB培養(yǎng)，實驗中2種原代培養(yǎng)方法所需新生乳鼠胎次、數(shù)量、體重保持一致。

1.2 主要試劑 DMEM(C11995500BT，GIBCO公司)、胎牛血清(A15-101，PAA公司);胰酶(SLBB4152，SAFC Bioscience公司);重組人TGF-β1(100-21，UK peprotech公 司)。兔 抗 α-SMA(1184-s，EPITOMICs公司);兔抗波形蛋白(vimentin，2707-1，EPITOMICs公司);兔抗 GAPDH(SC-25778，Santa Cruz公司);兔抗細胞角蛋白8(cytokeratin 8，CK8，2032-1，EPITOMICs公司);兔抗Ⅰ型膠原(BA0325，武漢博士德公司);羊抗兔IgG-AP(BA1011，武漢博士德公司);BCIP/NBT顯色試劑盒(E-116，Amresco公司);免疫組化SABC試劑盒(SA-1022，武漢博士德公司);DAB顯色試劑盒(ZLI-9032，北京中杉金橋公司)。

1.3 主要方法

1.3.1 胰蛋白酶消化法原代培養(yǎng)肺FB 超凈臺內(nèi)取出新生乳鼠雙肺，置于含青鏈霉素(1000 U/mL)PBS緩沖液中，洗2次去除血污，剪去肺門部;移入青霉素小瓶后用眼科剪剪碎至1 mm3大小，移入50 mL離心管中加入2倍體積0.25%胰酶37℃水浴消化30 min，加入2倍體積的10%FBS DMEM終止消化并吹打混勻。200目篩網(wǎng)過濾，800×g離心5 min;棄上清，加入體積分數(shù)為10%FBS DMEM培養(yǎng)基制備細胞懸液。37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天換液1次。

1.3.2 組織塊貼壁法原代培養(yǎng)肺FB 取肺步驟同胰蛋白酶消化法。將肺組織移入青霉素小瓶，加1 mL FBS并剪碎至1 mm3大小。均勻平鋪于培養(yǎng)瓶底部，棄去多余的FBS。將培養(yǎng)瓶底面朝上，加入5 mL 10%FBS DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4 h后將培養(yǎng)瓶恢復(fù)至正常。

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖 取2種原代培養(yǎng)方法第4代肺FB，制備細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整密度為2×104/mL，接種于 96孔板，每孔體積 100 μL。細胞貼壁后經(jīng)同步化24 h，分別于第1至7天連續(xù)檢測。每孔更換終濃度為0.5 g/L的MTT(900 μL DMEM+100 μL 5 g/L MTT 濃縮液)，繼續(xù)孵育 4 h，棄去MTT液，每孔加入150 μL的DMSO，避光搖床低速振蕩10 min，充分溶解紫色結(jié)晶。酶標儀490 nm波長檢測各孔A值，將每天檢測的各孔A值與第1天(同步化結(jié)束)A值的比值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.4 免疫細胞化學(xué)染色檢測 α-SMA、vimentin、細胞角蛋白的表達 常規(guī)制備細胞爬片［3］。4%多聚甲醛固定30 min，按免疫組化試劑盒說明書操作，高壓修復(fù)，H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA封閉30 min，一抗?jié)舛染鶠?∶200并4℃過夜，二抗孵育30 min，鏡下控制DAB顯色，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。其中α-SMA以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)交叉或平行排列的肌絲樣結(jié)果為陽性;vimentin為棕黃色標記的微絲樣結(jié)構(gòu);細胞角蛋白為細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.3.5 Western blot檢測 α-SMA的表達 常規(guī)提取細胞蛋白，BCA法檢測蛋白含量，50 μg/泳道上樣，電泳并電轉(zhuǎn)。5%BSA封閉 1 h后滴加 α-SMA(1∶200)、Ⅰ型膠原(1∶100)一抗 4℃過夜，滴加二抗4℃孵育1h，BCIP/NBT顯色純水終止顯色。掃描后經(jīng)IPP 6.0圖像分析軟件測定條帶A值，經(jīng)內(nèi)參平衡后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。A值用均數(shù)±標準差()表示。組間均數(shù)比較行成組t檢驗。方差齊采用LSD檢驗，方差不齊采用Satterwaite校正t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原代培養(yǎng)肺FB形態(tài)學(xué)觀察 如圖1所示，胰蛋白酶消化法原代培養(yǎng)24 h后換液，可見三角形或近梭形細胞貼壁。第3天幾乎所有細胞變?yōu)樗笮危家姸嘟切渭毎?組織塊貼壁法可見貼壁組織周邊有FB爬出;5～7 d后，2種原代方法均可見大量FB，其間均夾雜較多類圓形折光性較高的雜細胞，其中胰蛋白酶消化法密度較為均勻，密度為75%～95%;組織塊貼壁法可見貼壁組織周圍密集排列較多的肺FB，均為長梭形，呈束狀、流線型排列。胰蛋白酶消化法可在原代培養(yǎng)5～7d第1次傳代，而組織塊貼壁法則晚于同批次胰蛋白酶消化法2～3d。且在獲得等量細胞的條件下，胰蛋白酶消化法只需約每2只乳鼠，而組織塊貼壁法則需3～4只乳鼠。采用差速貼壁法傳至3代及以后，2種原代方法所獲得細胞均較純，雜細胞罕見。

2.2 免疫細胞化學(xué)染色鑒定細胞 分別選取2種不同原代培養(yǎng)方法的第4代乳鼠肺FB進行免疫細胞化學(xué)染色，可見vimentin陽性表達，見圖2a。而細胞角蛋白陰性表達，圖2b。提示2種方法原代培養(yǎng)獲得的第4代細胞中無上皮來源細胞，均為高純度的肺FB細胞。

2.3 肌FB分化模型的建立 如圖2c所示，2種方法所獲得的第4代細胞均無α-SMA陽性表達。予以5 μg/mL TGF-β1 刺激 3 h，可見部分細胞表達α-SMA標記的肌絲樣結(jié)構(gòu)，12 h可見一半以上的細胞α-SMA表達陽性，見圖2d。至24、48 h幾乎所有細胞均表達α-SMA，見圖2e。Western blot法驗證免疫細胞化學(xué)結(jié)果，可見α-SMA蛋白表達隨TGF-β1誘導(dǎo)時間延長而增加，同時Ⅰ型膠原表達也具有同樣的效應(yīng)，見圖3。

2.4 生長曲線測定 胰蛋白酶消化法及組織塊貼壁法培養(yǎng)的肺FB在7至10代以內(nèi)細胞均能保持自我增殖能力。取2種方法培養(yǎng)的第4代細胞，經(jīng)細胞計數(shù)(2×104/mL)后行MTT法繪制生長曲線均為S型，見圖4。各個時間點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 胰蛋白酶消化法與組織塊貼壁法原代培養(yǎng)FB的形態(tài)學(xué)觀察Figure 1 Morphology observation of the fibroblasts cultured by trypsin digestion(upper)tissue adherence(lower)

圖2 FB免疫組化染色圖Figure 2 Immunohistochemical staining of the myofibroblasts

圖3 Western blot法驗證免疫細胞化學(xué)法結(jié)果Figure 3 Results of immunocytochemistry verified by Western blot

圖4 肌FB分化比較Figure 4 Comparison of myofibroblast differentiation by tryosin digestion and tissue adherence

3 討 論

胰蛋白酶消化法和組織塊貼壁法是肺FB原代培養(yǎng)的2種主要方法。相較于其他細胞的體外培養(yǎng)，由于FB的較強增殖能力，其原代培養(yǎng)較為容易，而在其他細胞(如肺泡Ⅱ型上皮細胞原代培養(yǎng))的原代培養(yǎng)中，則需要通過差速貼壁法去除FB。本研究中，MTT法檢測生長曲線和免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示2種方法獲得的肺FB增殖能力和表型無差異，均具有快速自我增殖能力，并保持間質(zhì)細胞表型(vimentin表達陽性)，說明2種方法均能有效地獲得肺FB。兩者唯一的區(qū)別在于胰蛋白酶消化法能夠快速、大量獲得更多的肺FB，在乳鼠孕次、數(shù)量和體重以及培養(yǎng)條件一致的條件下，胰蛋白酶消化法能夠獲得更多的原代細胞，且傳代更為快速，對于需要快速獲得大量肺FB的實驗研究更具有優(yōu)勢。

培養(yǎng)體外FB常出現(xiàn)2種形態(tài)，一種為細長的針狀細胞形態(tài)，另一種為大而扁平的細胞形態(tài)。其中梭形細胞常見于原代細胞培養(yǎng)以及快速增殖期的FB，而扁平的細胞形態(tài)多見于在FB原代培養(yǎng)傳代過程中由于胰酶消化過度、傳代次數(shù)過多也常見此類細胞形態(tài)，一般認為肌FB具有此類細胞形態(tài)［4］。已有文獻報道，原代培養(yǎng)的FB可表達α-SMA，尤其在來源于成年大鼠、人以及疾病模型中的原代培養(yǎng)中［5］。而本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著傳代次數(shù)的增加，7至10代細胞已部分表達α-SMA，失去了體外建模的條件。故根據(jù)以往工作經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)中4代以內(nèi)的細胞，尤其是具有快速增殖能力的乳鼠肺FB大部分細胞無α-SMA陽性表達，適合建立體外誘導(dǎo)肌FB分化模型。TGF-β1是研究最多、最為深入且誘導(dǎo)肌FB分化效果最為明顯的細胞因子之一［6］，其誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化過程能較好的模擬矽肺等纖維化疾病中這種分化的分子過程。因此本研究選用TGF-β1進行肌FB分化的誘導(dǎo)，雖然較矽肺大鼠肺泡灌洗液上清或SiO2刺激的巨噬細胞上清液并不能完全模擬體內(nèi)矽肺發(fā)生、發(fā)展的環(huán)境，但其具有誘導(dǎo)條件穩(wěn)定、可控、迅速等特點。本研究隨著誘導(dǎo)時間的延長，α-SMA陽性表達細胞數(shù)目增多，至24、48h幾乎所有的細胞都表達α-SMA，同時Ⅰ型膠原蛋白表達上調(diào)，提示肌FB分化模型建立成功，這對進一步研究肌FB分化在器官纖維化中的作用具有一定的指導(dǎo)意義，同時也為研究矽肺纖維化提供了重要的體外培養(yǎng)模型。然而體外誘導(dǎo)的肌FB分化模型雖然較為簡單，但仍受諸多因素影響，如培養(yǎng)環(huán)境、誘導(dǎo)時間等。因此建立可穩(wěn)定表達α-SMA的肌FB分化模型是實驗的關(guān)鍵，這要求將在今后的工作中進一步探討與完善［7］。

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