抗-M抗體引起多次宮內(nèi)死胎的血型血清學(xué)及基因分析

馬 玲，劉衍春，吳敏慧，劉 毅，鄭 凌，薛 敏

0 引 言

母嬰間血型不合有可能導(dǎo)致胎兒及新生兒溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN)，該類溶血性疾病在新生兒期較為常見(jiàn)，主要是母體產(chǎn)生了針對(duì)胎兒紅細(xì)胞抗原的IgG型抗體，通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內(nèi)，與胎兒紅細(xì)胞上抗原結(jié)合，引起細(xì)胞聚集、破壞等一系列病理反應(yīng)，可以引起貧血、水腫、肝脾腫大，胎兒出生后短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)進(jìn)行性重度黃疸，嚴(yán)重者可發(fā)生膽紅素腦病，甚至導(dǎo)致死胎［1－3］。HDFN最常見(jiàn)的發(fā)生于 ABO系統(tǒng)，但癥狀一般較輕;其次是Rh系統(tǒng);此外MNS系統(tǒng)、Kidd系統(tǒng)、Digeo系統(tǒng)等引起HDFN的情況也偶見(jiàn)報(bào)道［4］。本研究對(duì)1例多次宮內(nèi)死胎的案例，通過(guò)其血清學(xué)及基因的分析，確診由抗-M抗體引起HDFN，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例簡(jiǎn)介 某經(jīng)產(chǎn)婦，34歲，無(wú)輸血史，2005－2012年共懷孕5次，其中第3胎B超提示胎心減弱，胎兒宮內(nèi)窘迫提前剖宮產(chǎn)娩出，產(chǎn)后新生兒貧血，肝脾腫大，Apgar評(píng)分2～4分，血紅蛋白124 g/L，總膽紅素58.7 μmol/L，直接膽紅素 14.2 μmol/L，紅細(xì)胞直抗為陽(yáng)性，輸注紅細(xì)胞懸液糾正貧血后血紅蛋白上升，因家屬擔(dān)心預(yù)后放棄治療，新生兒死亡;該經(jīng)產(chǎn)婦其余胎次均提示胎兒宮內(nèi)發(fā)育異常后流產(chǎn)，具體情況見(jiàn)表1。

表1 多次宮內(nèi)死胎經(jīng)產(chǎn)婦的孕產(chǎn)史情況Table 1 Pregnancy history of the woman with multiple intrauterine deaths

1.2 主要試劑與儀器 單克隆抗-A、抗-B、抗-D、抗-M、抗-N抗體、2-Me及篩選細(xì)胞(上海輸血技術(shù)公司);基因組DNA提取試劑盒(原平皓公司);人類 MNS，Duffy，Kell，Dombrock，Diego，Kidd，Scianna，Colton，Lutheran血型系統(tǒng)基因分型檢測(cè)試劑盒(天津秀鵬生物技術(shù)公司);Labofuge 400R低溫高速離心機(jī)(Heraeus Corp，Germany);PE9600PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystem Corp，USA);AlphalmagerHP凝膠成像系統(tǒng)(Alphalmager Corp，USA)。

1.3 方法

1.3.1 血型鑒定 采集該夫婦(以下簡(jiǎn)稱母親、父親)外周靜脈血，血樣經(jīng)EDTA抗凝，試管法常規(guī)ABO正反定型，RhD血型及MN血型定型。另對(duì)該夫婦MN血型進(jìn)行基因分型:各取0.5 mL全血，用DNA提取試劑盒提取DNA;根據(jù)人類MNS，Duffy，Kell，Dombrock，Diego，Kidd，Scianna，Colton，Lutheran血型系統(tǒng)基因分型檢測(cè)試劑盒要求，調(diào)整DNA模板濃度約為30ng/μL，進(jìn)行PCR-SSP擴(kuò)增;取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照分析。

1.3.2 抗體篩查與鑒定 取母親血清與譜細(xì)胞進(jìn)行鹽水介質(zhì)和抗人球試驗(yàn)，根據(jù)譜細(xì)胞格局判斷母親血清中抗體的存在與否及種類。

1.3.3 抗體效價(jià) 用2-Me室溫處理母親血清30 min，破壞IgM型抗體后，用O型、MM純合子紅細(xì)胞檢測(cè)IgG型抗-M效價(jià)，共檢測(cè)4次。

2 結(jié) 果

2.1 血型 血清學(xué)結(jié)果:母親血型:A，RhD+，N+;父親血型:A，RhD+，M+;第3胎新生兒血型:A，RhD+，M+N+?；蛐徒Y(jié)果:母親基因型:NN;父親基因型:MM，結(jié)果見(jiàn)圖1(箭頭所指處分別為N和M目的條帶)。

圖1 MN血型基因PCR結(jié)果Figure 1 PCR genotyping of the MN blood type

2.2 抗體篩查與鑒定 母親血清與MM，MN譜細(xì)胞在鹽水介質(zhì)和間接抗人球蛋白試驗(yàn)IAT(indirect antiglobulin test，IAT)中均有反應(yīng)，而與NN細(xì)胞無(wú)反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)格局可以確定為抗-M抗體，且為IgM型與IgG混合型，具體格局見(jiàn)表2。

表2 孕婦血清與譜細(xì)胞反應(yīng)格局Table 2 Reaction pattern of maternal serum

2.3 抗體效價(jià) 2011年10月，孕前檢測(cè)，為1∶8;2011年11月，第4胎孕4w+6時(shí)，為1∶32;2011年12月，第4胎孕10w+5時(shí)，為1∶32;2012年10月，第5胎孕6w+5時(shí)，為1∶64。

3 討 論

MNS血型系統(tǒng)是繼ABO后第2個(gè)被發(fā)現(xiàn)的血型系統(tǒng)，其復(fù)雜性僅次于Rh系統(tǒng)，含有46個(gè)抗原［5］;MNS系統(tǒng)的大多數(shù)抗原在出生時(shí)即發(fā)育完全。其中熟知的與HDFN相關(guān)抗原包括:M、N、S、s及U抗原，前兩者位于血型糖蛋白A上，后三者位于血型糖蛋白B上，都為一次穿膜蛋白。紅細(xì)胞膜上高表達(dá)血型糖蛋白A，約106個(gè)/細(xì)胞，血型糖蛋白B的表達(dá)略低，約2×105個(gè)/細(xì)胞;由于M抗原的高表達(dá)，一些高滴度的IgG性質(zhì)抗體在鹽水條件下也能凝集紅細(xì)胞;而一些高滴度的IgM性質(zhì)抗體在37℃仍與紅細(xì)胞有反應(yīng)。此外需要注意的是，血型糖蛋白B蛋白位于細(xì)胞膜外的26個(gè)氨基酸殘基序列同N抗原序列一樣，導(dǎo)致一些抗-N試劑也可以與純合子的MM紅細(xì)胞發(fā)生弱凝集，因此在表型鑒定、解釋結(jié)果的時(shí)候需謹(jǐn)慎。

抗-M抗體屬于MNS系統(tǒng)中較為常見(jiàn)的一種抗體，大多數(shù)抗-M抗體為IgM型，無(wú)補(bǔ)體結(jié)合性質(zhì)，只在低于37℃的溫度下有反應(yīng)，且最適反應(yīng)溫度為4℃，因此臨床意義不大。但是少數(shù)抗-M抗體為IgG性質(zhì)，能夠引起急性和遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)及HDFN?？?M抗體具有幾個(gè)特點(diǎn)［6］:一是劑量效應(yīng)，與純合子細(xì)胞反應(yīng)明顯強(qiáng)于雜合子細(xì)胞，因此對(duì)于一些較弱的抗體，需用純合子細(xì)胞才能驗(yàn)證;二是pH值依賴性?？?M抗體的最適反應(yīng)pH值為6.5，高于7.5時(shí)幾乎無(wú)反應(yīng)性，低于pH6.5時(shí)變得無(wú)特異性;實(shí)驗(yàn)時(shí)，適當(dāng)加入EDTA等酸性溶液可以增強(qiáng)弱抗體與紅細(xì)胞的反應(yīng)。

高翔羽等［7］在總結(jié)分析了國(guó)內(nèi)20余例抗-M抗體引起 HDFN的報(bào)道后發(fā)現(xiàn)，抗-M抗體引起的HDFN其病情輕重程度差異較大。有些患兒表現(xiàn)為不同程度的貧血、黃疸，給予光照治療或靜脈注射免疫球蛋白后治愈;但少部分嚴(yán)重者需要換血甚至導(dǎo)致死胎。本文報(bào)道的案例即為極少數(shù)嚴(yán)重案例，母親為N+表型，父親為M+表型，且基因分型的結(jié)果進(jìn)一步佐證了血清學(xué)結(jié)果，都為純合子;母親體內(nèi)檢出抗-M抗體，該抗體引起多次宮內(nèi)死胎，且病因?qū)W在第3胎產(chǎn)后才被確診。

抗-M抗體效價(jià)的高低并不能直接反應(yīng)HDFN的嚴(yán)重程度。Wikman等［8］發(fā)現(xiàn)效價(jià)低至1的抗-M抗體也可引起嚴(yán)重的HDFN;Poole和Daniels［9］認(rèn)為用自動(dòng)分析儀檢測(cè)抗體的含量比檢測(cè)血清滴度更能有效地預(yù)測(cè)HDFN的嚴(yán)重水平;當(dāng)抗體含量水平較高時(shí)(10～15 U/mL)，就可能需要用羊水或臍帶血來(lái)進(jìn)一步估計(jì)胎兒的溶血情況。一些細(xì)胞生物學(xué)的方法，如抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用、單核細(xì)胞單層試驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)?zāi)軌蚋行У仡A(yù)測(cè)HDFN的嚴(yán)重性。

抗-M抗體導(dǎo)致的HDFN，其細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗(yàn)(direct antiglobulin test，DAT)也可以是陰性。Wikman等［8］用51Cr分別標(biāo)記M+N－和M－N+紅細(xì)胞，注射于含有抗-M抗體的經(jīng)產(chǎn)婦體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)M+N-紅細(xì)胞半衰期為2 h，4 h后標(biāo)記的細(xì)胞即被清除;而M-N+紅細(xì)胞有著正常地生存期，29 d后仍有50%的標(biāo)記細(xì)胞存活。這可能解釋了紅細(xì)胞DAT陰性的原因，即血管內(nèi)清除較快;Wikman還提出DAT陰性的另一個(gè)可能原因，即與抗-K，抗-Ge導(dǎo)致的HDFN機(jī)制類似，MNS等抗原表達(dá)于紅系祖細(xì)胞上，抗-M更多的是導(dǎo)致了紅系祖細(xì)胞的破壞而非成熟的紅細(xì)胞［10］。

目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院并未將MN血型檢查列入常規(guī)檢查項(xiàng)目，又因?yàn)榭?M抗體引起的HDFN臨床發(fā)生率較低，故臨床醫(yī)師對(duì)此病的認(rèn)識(shí)較為陌生，易引起漏診及誤診。總之，對(duì)于原因不明的多次死胎，流產(chǎn)等，在排除了其他可能因素后，需要考慮到抗-M抗體或其他血型抗體引起的可能性。

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