3種醫(yī)院軟膏劑微生物限度檢查方法學研究

陳媛 吳楣 藍紅梅 等

[摘要] 目的 建立氯達軟膏、利唑軟膏、硫磺軟膏醫(yī)院軟膏劑微生物限度檢查方法。 方法 按《中國藥典》2010年版二部微生物限度檢查法中對細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法和控制菌檢查法進行驗證。 結果 氯達軟膏和利唑軟膏細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)檢查采用薄膜過濾法，控制菌檢查均采用薄膜過濾法；硫磺軟膏細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)檢查采用培養(yǎng)基稀釋法，控制菌金黃色葡萄球菌檢查采用培養(yǎng)基稀釋法，銅綠假單胞菌檢查采用常規(guī)法。 結論 醫(yī)院軟膏制劑必須通過方法驗證試驗建立合理的檢驗方法，以保證檢驗結果的準確性。

[關鍵詞] 微生物限度；方法驗證；回收率； 醫(yī)院制劑；軟膏

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）12-105-03

氯達軟膏、利唑軟膏、硫磺軟膏作為梅縣慢性病防治院常用的醫(yī)生處方藥，在臨床被廣泛應用，原質量標準無微生物限度檢查方法學驗證，為控制產品質量，確保安全用藥，本文按照《中國藥典》2010年版二部規(guī)定[1]進行微生物方法學驗證。根據(jù)制劑抑菌活性的強弱和對不同菌種抑菌程度的大小選擇適當?shù)臋z查方法，加入5種驗證試驗菌株：枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球、白色念珠菌、黑曲霉菌于氯達軟膏、利唑軟膏和硫磺軟膏中，對各試驗菌的回收率進行驗證，建立氯達軟膏、利唑軟膏和硫磺軟膏細菌、霉菌及酵母菌檢出方法；控制菌以加入2種驗證試驗菌株：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌進行檢出實驗，建立氯達軟膏、利唑軟膏和硫磺軟膏控制菌檢查方法。

1 試藥與儀器

1.1 試驗樣品

氯達軟膏（批號分別為130629，130712，130718；利唑軟膏（批號分別為13720，130625，130723），硫磺軟膏（批號分別為130610，130615，130623）均由梅縣慢性病防治院提供。

1.2 驗證用儀器

電熱恒溫鼓風干燥箱、BSC-1300ⅡA2生物安全柜、DNP-9052BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱、HCB602H電子分析天平（0.01g）、ZW-808A微型智能集菌儀、一次性無菌過濾器、ZW-808D智能勻漿儀、臥式滅菌器、HH.Bll.500-電熱恒溫培養(yǎng)箱、SPX-150型生化培養(yǎng)箱等

1.3 試驗菌株

枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501-2a1]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003-5a]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102-3a]、白色念珠菌[CMCC（F）98001-3a]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104-2a]黑曲霉[CMCC（F）98003-1a]均由中國食品藥品檢定研究院提供，以上菌株傳代次數(shù)均不超過5代。

1.4 驗證用培養(yǎng)基及稀釋劑

pH=7.0的氯化鈉一蛋白胨緩沖液（批號：1112292）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：3101032）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：201112262）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號：3101466）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號：3101223）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：201112231）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號：3101078）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：120315），溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號：110223）均由北京三藥科技開發(fā)公司或廣東環(huán)凱微生物有限公司出品。其他試劑均為分析純或化學純。

2 方法與結果

2.1 菌液制備[1-12]

接種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度（34±1）℃，培養(yǎng)24h，接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，培養(yǎng)46h，將上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1毫升含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，培養(yǎng)6d，加入4mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1毫升含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。

2.2 供試品溶液制備[1-12]

氯達軟膏、利唑軟膏供試液：取氯達軟膏10.12g、利唑軟膏9.95g，分別加至含20mL無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的二個三角瓶中，充分振搖使供試品溶解后，各加入45℃的pH=7.0的無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液100mL，振搖6min，靜置使油水明顯分層，取其水層，作為1∶10的供試液。

硫磺軟膏供試液：取硫磺軟膏5.05g，加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團后，加入45℃ 的pH=7.0的無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液至100mL，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1︰20的供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證[1-12]

試驗組：取按“2.2”項下制備的供試品溶液1mL和試驗菌液1mL按常規(guī)法：取供試液1mL注皿；培養(yǎng)基稀釋法：取供試品溶液1mL注入10個平皿（0.1mL/皿）；離心法：取一定量的供試品溶液，以500 r/min離心5min，取上清液試驗；薄膜過濾法：取供試品溶液1mL，采用薄膜過濾法，依法檢查，以pH=7.0的無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液為沖洗液。

菌液組：取1mL試驗組中相同稀釋級的菌懸液，同法測定其菌數(shù)，得出試驗組中加入的菌數(shù)。每株試驗菌平行制備2個平皿，計算平均菌落數(shù)。

供試品對照組：取與試驗組同一供試品溶液和方法，不加菌液，測定樣品本底菌。

稀釋劑對照組：用pH=7.0的無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液替代供試品，加入試驗菌，按試驗組的方法測定其菌落數(shù)。

計算公式：

結果判斷：稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率應均不低于70%，若3次獨立平行試驗中試驗組的菌數(shù)回收率均不低于70%，則說明可照該供試品溶液制備方法和計數(shù)方法測定該供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)。若任一次試驗中試驗組的菌數(shù)回收率低于70%，則說明所采用的方法不可行，應改用其他方法（離心法、中和法、薄膜過濾法等）消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證。驗證試驗結果見表1（表中薄膜過濾法：沖洗量為100mL×3次。）

上表試驗結果表明，3個樣品中的枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌3個菌株回收率試驗，氯達軟膏、利唑軟膏抑菌作用較強，需采用離心法+薄膜過濾法聯(lián)用消除供試品的抑菌活性；而硫磺軟膏則用培養(yǎng)基稀釋法0.1mL/皿，回收率能達到70%以上；氯達軟膏、利唑軟膏白色念珠菌和黑曲霉的回收率試驗需用離心法+薄膜過濾法聯(lián)用、硫磺軟膏用培養(yǎng)基稀釋法（0.1mL/皿）回收率才能達到70%以上。

2.4 控制菌檢查法的驗證

試驗組： 取 “2.2”項下制備的供試品溶液10mL和50～100cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應控制菌檢查法進行檢查。

陰性對照組： 除菌液為大腸埃希氏菌1mL（10～100cfu），方法同試驗組。

上表試驗結果表明，氯達軟膏與利唑軟膏因其抑菌作用較強，只能采用離心法+薄膜過濾法檢查金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌；硫磺軟膏用培養(yǎng)基稀釋法檢查金黃色葡萄球菌（200mL）及常規(guī)法檢查銅綠假單胞菌。

3 討論

上述細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證及控制菌檢查法的驗證數(shù)據(jù)表明，3種醫(yī)院外用軟膏制劑均不能按常規(guī)法檢查微生物限度， 抑菌作用較強的品種氯達軟膏和利唑軟膏需要采用離心法+薄膜過濾法進行微生物限度檢查，而硫磺軟膏則用培養(yǎng)基稀釋法可進行微生物限度檢查。

軟膏劑供試品的制備一直比較繁瑣，筆者采用中國藥典規(guī)定非水溶性供試品的兩種制備方法，發(fā)現(xiàn)平皿法測定供試品時，用藥典規(guī)定的方法1更適合；方法2的十四烷酸異丙酯容易與一次性塑料培養(yǎng)皿發(fā)生反應，使培養(yǎng)皿表面變白，難以計數(shù)。因此，在2.2 供試品溶液制備中采用了兩種供試品溶液制備方法。

采用藥典規(guī)定非水溶性供試品的方法2時，如供試品難溶，可嘗試用勻漿儀低速檔混溶，在供試品的沖洗液中加入1%無菌聚山梨酯80[13]，可以明顯減少薄膜上藥物的殘留，使計數(shù)更準確。

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（收稿日期：2014-03-13）