栽培艾納香單株左旋龍腦和總黃酮含量變異分析△

于福來，黃梅，龐玉新*，王丹，謝小麗，陳振夏

(1.中國熱帶農業(yè)科學院 熱帶作物品種資源研究所/農業(yè)部華南作物基因資源與 種質創(chuàng)制重點開放實驗室，海南 儋州 571737； 2.海南省艾納香工程技術研究中心 海南 儋州 571737)

栽培艾納香單株左旋龍腦和總黃酮含量變異分析△

于福來1，2，黃梅1，2，龐玉新1，2*，王丹1，2，謝小麗1，2，陳振夏1，2

(1.中國熱帶農業(yè)科學院 熱帶作物品種資源研究所/農業(yè)部華南作物基因資源與 種質創(chuàng)制重點開放實驗室，海南 儋州 571737； 2.海南省艾納香工程技術研究中心 海南 儋州 571737)

目的：探討艾納香栽培群體內主要化學成分個體變異規(guī)律，為艾納香優(yōu)良品種的定向選育奠定基礎。方法：選取同一栽培環(huán)境下相同株齡100個艾納香單株，采用GC測定左旋龍腦含量，紫外可見分光光度法測定總黃酮含量。通過相關分析、標準差法分組比較等方法分析化學成分單株變異規(guī)律。結果：100個單株艾納香左旋龍腦變異系數為37.39%，總黃酮變異系數為20.13%；分組后左旋龍腦和總黃酮含量分別在3個組別間差異達到極顯著(P<0.001)水平；相關分析表明，兩類成分間存在正相關關系(r=0.084，n=100)，但不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論：艾納香栽培群體內單株化學成分含量變異較大，可為高含量育種提供材料。此外，艾納香葉片中左旋龍腦和總黃酮積累不具有協(xié)同性，應分別對其進行選擇。

艾納香；左旋龍腦；總黃酮；單株變異；定向選育

艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.為菊科多年生草本植物，在我國廣泛分布于海南、貴州、廣西、云南等省區(qū)[1]。艾納香新鮮葉片經水蒸氣蒸餾、升華等一系列處理可制得中藥艾片(主要為左旋龍腦)，具開竅醒神，清熱止痛之功效[2]。此外，艾納香中還含有黃酮等多種活性成分[3-4]。

艾納香人工種植歷史已有近百年，但長期以來，艾納香藥材以野生為主，優(yōu)良品種缺乏的現狀仍未改變，規(guī)范化生產技術研究與推廣工作仍未落實到位，這直接導致艾納香藥材質量不穩(wěn)定，難于有效控制。而通過人工定向選育良種是提高和穩(wěn)定艾納香藥材質量的根本途徑。艾納香具有無性克隆繁殖特性[5]，通過系統(tǒng)選育優(yōu)良單株，建立優(yōu)良材料無性系是實現艾納香品種選育的重要途徑。植物化學成分為數量性狀，其合成積累受基因型和環(huán)境雙重因素影響。以往研究對不同產地、不同季節(jié)以及不同部位艾納香在揮發(fā)性成分和黃酮類成分含量比較方面報道較多[6-8]，然而同一生長環(huán)境不同單株間化學成分含量變異的研究未見報道。

基于此，本研究從艾納香化學成分定向選擇角度出發(fā)，通過測定同一栽培環(huán)境下相同株齡100株艾納香單株的左旋龍腦和總黃酮含量，進而闡釋艾納香栽培群體內化學成分在個體間變異規(guī)律，以期為高含量材料的選擇提供依據，為優(yōu)良艾納香品種的定向選育奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

2013年12月于海南儋州艾納香栽培基地隨機標記100個同一年生單株(實生苗)，每株選取功能葉片20片，陰干后粉碎作為測試樣品。以上材料經中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所龐玉新副研究員鑒定為艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.。

1.2 試驗儀器

安捷倫7890A氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器(FID)，安捷倫G4513A 16位自動進樣器，Sartarius CPA225D電子分析天平，KQ-500DB型超聲儀，UNICO2012-PCS紫外分光光度計，左旋龍腦對照品(阿法埃莎化學有限公司，純度>98%)，蘆丁標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號為100080-200707，純度為92.5%)，水楊酸甲酯(天津光復精細化工研究所，純度>99.5%)，乙酸乙酯，亞硝酸鈉NaNO2、硝酸鋁Al(NO3)3·9H2O、氫氧化鈉、乙醇等試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 左旋龍腦含量測定

2.1.1 色譜條件 HP-5石英毛細管色譜柱(0.32 mm×30 m，0.25 μm)；以80 ℃為起始溫度，保持2 min，然后以5 ℃/min升溫至100 ℃，再以20 ℃/min升溫至200 ℃；進樣口溫度為220 ℃；FID檢測器溫度為240 ℃；進樣量0.6 μL，分流比為9∶1。左旋龍腦對照品和艾納香供試品色譜圖見圖1。

2.1.2 供試品的制備 精密稱定艾納香葉片粉末(過20目篩)約2 g，置于50 mL具塞三角瓶中，加入乙酸乙酯25 mL，稱定重量，在40 kHz的超聲條件下提取30 min，放冷，用乙酸乙酯補足減失的重量，搖勻，濾過，取1 mL續(xù)濾液至10 mL容量瓶中，加入1 mL內標液(見2.1.3項下)，用乙酸乙酯定容，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.1.3 線性關系的考察 精密稱定左旋龍腦對照品約100 mg，加乙酸乙酯定容至100 mL作為對照液。精密稱定水楊酸甲酯約250 mg，加乙酸乙酯定容至250 mL作為內標液。量取對照液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL置于10 mL容量瓶中，同時加入內標溶液1.0 mL，以乙酸乙酯定容至刻度，即得混合對照品溶液。按照2.1.1項下的色譜條件測定。以對照品中左旋龍腦質量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(X)，對照品左旋龍腦與內標物水楊酸甲酯的峰面積比為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為：Y=14.823X+0.0129，r=0.999 9，結果表明，左旋龍腦在10.371～207.428 μg·mL-1與峰面積呈良好線性關系。

1.左旋龍腦 2.水楊酸甲酯圖1 左旋龍腦對照品(A)和供試品(B)色譜圖

2.1.4 精密度試驗 取某一艾納香藥材，按2.1.2項下操作制備供試品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)重復進樣6次，記錄色譜圖。結果左旋龍腦與水楊酸甲酯的相對峰面積的RSD值為2.1%，表明精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 取同一艾納香藥材5份，按2.1.2項下操作制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，結果測得左旋龍腦含量的RSD為3%，表明重復性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取艾納香藥材1份，按2.1.2項下操作制備供試品溶液，于室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h各進樣一次，左旋龍腦與內標物的相對峰面積的RSD為0.49%，表明樣品在24小時內穩(wěn)定性良好。

2.1.7加樣回收率試驗 精密稱定6份已知含量的艾納香葉片粉末約1 g，每份樣品精密加入左旋龍腦標準品約5 mg，按2.1.2項下方法制備，在上述色譜條件下進行分析，結果得回收率在80%～120%之間，RSD為2.44%，表明回收率較高。

2.1.8 樣品含量測定 按照2.1.2項下操作制備樣品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，根據線性方程計算不同單株艾納香中左旋龍腦的含量。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 顯色劑的配制 稱取25 g NaNO2，用蒸餾水定容至500 mL，配成5%的NaNO2溶液，備用；稱取88 g Al(NO3)3·9H2O，用蒸餾水定容至500 mL，配成10%的Al(NO3)3溶液，備用；稱取20 g的NaOH，用蒸餾水定容至500 mL，配成4%的NaOH溶液，備用。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定于105 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品約12 mg，置于50 mL容量瓶中，加75%乙醇溶液，置水浴鍋上微熱溶解，放冷，加75%乙醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定艾納香藥材粉末(過20目)約0.5 g，至具塞錐形瓶中，加75%乙醇溶液25 mL，稱定重量，在40 kHz下超聲提取40 min，放冷，稱量，用75%的乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，即得供試品。

2.2.4 測定波長的選擇 分別精密量取對照品溶液2.0 mL、供試品0.5 mL，將其分別置于25 mL容量瓶中，各加75%乙醇至10 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置5 min，加10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，放置5 min，加4% NaOH溶液10 mL，最后以75%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑溶液為空白，在300～999 nm波長間進行全波長掃描，綜合分析選擇適宜測定波長為509 nm。吸收曲線如圖2所示。

圖2 全波長掃描圖

2.2.5 線性關系的考察 精密量取對照品溶液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL分別置于25 mL容量瓶中，按2.2.4項下方法進行顯色反應，以相應的試劑溶液為空白對照，在509 nm處測定吸光度A。以對照品濃度C為橫坐標(X)，吸光度A為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為Y=12.847X+0.009 3，r=1.000，結果表明，總黃酮在9.176～73.408 μg·mL-1與吸光度呈良好線性關系。

2.2.6 精密度試驗 取某一濃度的對照品溶液2 mL，置于25 mL的容量瓶中，按標準曲線繪制項下操作，測定吸收值，連續(xù)6次，RSD值為1.05%，表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性實驗 取某一濃度供試液，置于25 mL容量瓶中，按2.2.5項下操作，每隔10 min測定其吸光度，共計60 min，分析得出溶液在顯色后40 min內RSD值為1.89%，表明在40 min內比較穩(wěn)定。

2.2.8 重復性實驗 取同一批樣品按2.2.3項下操作平行制備供試品溶液6份，按2.2.5項下操作，測定其吸光度，計算得平均濃度為13.91%，RSD值為3.8%。

2.2.9 加樣回收試驗 精密稱取6份已知濃度的艾納香藥材粉末(過20目篩)50 mg，分別加入相當于供試品溶液總黃酮質量的蘆丁對照品約7 mg，按2.2.3項下制備供試液，按2.2.5項下操作測定吸收值，結果得平均回收率為110%，RSD值為2.7%。

2.2.10 樣品含量測定 按照2.2.3項下方法進行樣品溶液制備，按2.2.5項下操作測定供試品吸光度值，計算各不同單株艾納香中總黃酮的含量。

3 結果與分析

3.1 不同單株艾納香葉片左旋龍腦和總黃酮含量基本統(tǒng)計量

依據100株艾納香葉片左旋龍腦和總黃酮含量數據統(tǒng)計結果如下(表1和圖3)，兩組數據符合正態(tài)分布。其中，左旋龍腦最大值達10.71 mg·g-1，最小值僅1.50 mg·g-1，變異系數為37.39%。而總黃酮最大值206.59 mg·g-1，最小值為65.63 mg·g-1，變異系數為20.13%。說明艾納香栽培群體內單株間化學成分含量差異顯著。

表1 不同單株艾納香葉片左旋龍腦和總黃酮含量基本統(tǒng)計量 /mg·g-1

圖3 艾納香單株葉片左旋龍腦和總黃酮含量正態(tài)分布

3.2 不同組別艾納香單株左旋龍腦和總黃酮含量差異分析

采用標準差法進行分組，均值加1倍標準差定為高、中組別臨界值，均值減1倍標準差定為中、低組別臨界值。據此將100個單株左旋龍腦和總黃酮含量數據劃分為高、中、低三組，同時對不同組別采用Duncan’s 法進行多重比較，其結果列于表2。兩類成分在三個組別間差異達到極顯著(P<0.001)水平。其中，左旋龍腦高含量組占14%，總黃酮高含量組占15%。結果提示，從現有栽培群體內可實現優(yōu)良單株選擇。

表2 不同組別艾納香單株左旋龍腦和總黃酮含量差異分析

注：不同組別間多重比較采用Duncan’s法(P<0.001)

3.3 艾納香葉片左旋龍腦與總黃酮含量相關分析

為探討左旋龍腦與總黃酮在艾納香葉片中積累的協(xié)同性，進一步通過Pearson相關分析(圖4)表明，兩者之間存在正相關關系(r=0.084，n=100)，但不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果提示，同時選擇左旋龍腦和總黃酮高含量單株存在較大難度。

圖4 艾納香葉片左旋龍腦與總黃酮含量Pearson相關分析

4 結論與討論

4.1 艾納香栽培群體內單株化學成分含量變異較大，可為高含量育種提供材料

艾納香是具有克隆生長習性的多年生宿根性草本植物[5]，因此通過系統(tǒng)選育高含量單株，建立優(yōu)良材料無性系是實現艾納香品種選育的重要途徑。變異是選擇的基礎，對發(fā)生變異的生物體按照一定的方向和目標連續(xù)選擇，就能使變異逐漸積累、鞏固和加強[9]。艾納香栽培群體內左旋龍腦和總黃酮含量在單株間表現出較大差異，變異系數分別為37.39%和20.13%。同時左旋龍腦含量最大值(10.71 mg·g-1)和最小值(1.50 mg·g-1)相差達7.14倍；總黃酮含量最大值(206.59 mg·g-1)和最小值(65.63 mg·g-1)亦相差3.15倍。因此，當以左旋龍腦或總黃酮為育種目標時，從現有栽培群體內篩選高含量單株具有較大的選擇潛力。

4.2 艾納香葉片中左旋龍腦和總黃酮積累不具有協(xié)同性，應分別對其進行選擇

本研究通過對100個樣本的左旋龍腦和總黃酮相關分析表明，兩類成分不具有統(tǒng)計學意義的相關性(P>0.05)。提示兩類成分在葉片中積累不具有協(xié)

同性。左旋龍腦為莰烷型雙環(huán)單萜類化合物，是發(fā)生在質體內的脫氧木酮糖-5-磷酸途徑[10]。黃酮類化合物的生物合成是通過苯丙烷代謝途徑完成[11]。同時，植物次生代謝產物合成存在組織分布特異性和積累時期特異性。所以，以左旋龍腦或總黃酮為育種目標時，對優(yōu)良材料進行選擇時應將兩類成分分開選擇。

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IndividualVariationofl-borneolandTotalflavonoidsContentinBlumeabalsamifera(Ai-na-xiang)CulturedPopulation

YUFulai1，2，HUANGMei1，2，PANGYuxin1，2*，WANGDan1，2，XIEXiaoli1，2，CHENZhenxia1，2

(1.TropicalcropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementinSouthernChina，Danzhou571737，China； 2.HainanProvincialEngineeringResearchCenterforBlumeaBalsamifera，Danzhou571737，China)

Objective：This study aimed at analyzing the individual variation ofl-borneol and total flavonoids content inBlumeabalsamifera(Ai-na-xiang)cultured population，which provides a theoretical basis for theB.balsamiferadirectional selection breeding with high-content bioactive components.Methods：The content ofl-borneol and total flavonoids randomly chosen from 100 one-year-old plants growing in the same field was determined by GC and UV respectively.Simple correlation analysis and standard deviation grouping were used to analyze the individual variation ofl-borneol and total flavonoids content.Results：The coefficients of variation(CV)ofl-borneol and total flavonoids content were 37.39% and 20.13% respectively.There were highly significant differences(P<0.001)ofl-borneol and total flavonoids content among three groups after standard deviation method grouping.Simple correlation showed thatl-borneol had positive correlation(r=0.084，n=100)with total flavonoids but not significant(P>0.05).Conclusion：Great individual variation ofl-borneol and total flavonoids content inB.balsamiferacultured population is beneficial for bioactive components directional selection breeding.There were different selective effects onl-borneol and total flavonoids for the accumulation ofl-borneol is inconsistent with that of total flavonoids inB.balsamifera.

Blumeabalsamifera；l-borneol；Total flavones；Individual variation；Directional selection

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.08.010

2014-03-23)

國家自然科學基金(81303171，81374065)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項(1630032013006)

*

龐玉新，副研究員，研究方向：南藥資源開發(fā)與利用；Tel：(0898)23300268，E-mail：pyxmarx@126.com