藏藥俄色葉中根皮苷、根皮素含量分析△

夏冬梅，李敏*，王道清，楊冰月，敬勇

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137； 2.中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137； 3.中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137)

藏藥俄色葉中根皮苷、根皮素含量分析△

夏冬梅1，2，3，李敏1，2，3*，王道清1，2，3，楊冰月1，2，3，敬勇1，2，3

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137； 2.中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137； 3.中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137)

目的：建立測定藏藥俄色葉中根皮苷、根皮素含量分析的方法。方法：根皮苷含量采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測定，以甲醇為提取溶劑。根皮素含量采用HPLC進(jìn)行含量測定，以40%乙醇為提取溶劑，以乙腈和0.04%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1 mL·min-1；檢測波長為286 nm；柱溫為30 ℃。結(jié)果：根皮苷與藥材提取液的最大吸收波長一致。在此色譜條件下，根皮素色譜峰與其他色譜峰達(dá)到基線分離，平均回收率為102.6%，RSD=2.61%。19批俄色葉中根皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.11%，根皮素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.51%。結(jié)論：該研究建立的方法能快速準(zhǔn)確地測定俄色葉中根皮苷、根皮素的含量，可作為該藥質(zhì)量評價(jià)的參考依據(jù)，為俄色葉的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

俄色葉；根皮苷；根皮素；含量分析

藏藥俄色葉為薔薇科蘋果屬隴東海棠系植物變?nèi)~海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes或花葉海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid的干燥葉，長期以來，在藏區(qū)多作保健食品用，常與酥油同煮口服，但關(guān)于俄色葉近代藥用文獻(xiàn)尚無，只在《藏藥晶鏡本草》和《四部醫(yī)典》中有記載，具有保肝利膽、除膩滌滯、攻堅(jiān)化積等功效[1-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，俄色葉總黃酮具有降血脂、降血糖的功效[5-7]。俄色葉主要含黃酮類成分，以二氫查爾酮類為主，如根皮素、根皮苷[8]，其中根皮素是首次從俄色葉原植物中分離得到，根皮素具有抗癌[9]、抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[10]、預(yù)防骨質(zhì)疏松[11]、保護(hù)心血管等活性[12]；根皮苷具有明顯的降血糖、降血脂[13]和保肝作用[14]，其二者藥理活性與俄色葉總黃酮的藥理作用相符。

目前，俄色葉已收載于《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》中，本研究以根皮苷、根皮素作為俄色葉質(zhì)量評價(jià)的指標(biāo)，建立其含量測定方法，這將有助于合理開發(fā)俄色葉資源，同時(shí)為這一民族藥的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent technologies 1200 高效液相色譜儀(四元梯度泵、1260 Infinity標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器、1260 DAD檢測器)；UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BP-12l s精密電子天平(浙江精密儀器有限公司)。

1.2 材料

19批俄色葉藥材樣品均為2011年從四川省甘孜州采集而得，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為薔薇科蘋果屬植物變?nèi)~海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes和花葉海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid 的干燥葉，除2011年5月采集樣品均為幼嫩的小葉外，其余樣品均為大葉。俄色葉樣品信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地及不同采收時(shí)間的俄色葉樣品信息

根皮素對照品(自制，純度99.7%)；根皮苷對照品(曼思特生物有限公司，批號：MUST-12032102，純度為98%)；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

根皮素對照品：為俄色葉的乙酸乙酯部位分離所得，并經(jīng)MS和NMR鑒定；按照本方法的色譜條件歸一化法測得其純度為99.7%。理化數(shù)據(jù)如下：淺粉紅色粉末(甲醇)，TLC紫外燈下噴三氯化鋁顯色劑顯亮藍(lán)色。鹽酸鎂粉反應(yīng)顯陽性，初步判斷為黃酮類或黃酮醇類化合物，分子式：C15H14O5。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：2.78(2H，d，J=7.6 Hz，β-H)，3.23(2H，d，J=7.6 Hz，α-H)，5.82(2H，s，H-3′，5′)，6.68(2H，d，J=8.5Hz，H-3，5)，7.03(2H，s，H-2，6)，9.12(1H，s，4-OH)，10.33(1H，s，4′-OH)，12.23(2H，s，2′，6′-OH)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：30.0(C-β)，45.9(C-α)，94.4(C-3′，C-5′)，103.9(C-1′)，114.7(C-3，C-5)，128.9(C-2，C-6)，132.5(C-1)，155.0(C-4)，164.4(C-2′，C-6′)，164.7(C-4′)，205.0(C=O)。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對比鑒定為根皮素(Phloretin)[15]，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 根皮素化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 方法與結(jié)果

2.1 根皮苷含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取根皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含200 μg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取俄色葉藥材細(xì)粉0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，搖勻后，稱定重量，超聲提取30 min，甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密吸取續(xù)濾液0.2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 測定波長的選擇 吸取根皮苷對照品溶液及供試品溶液各適量，以甲醇作空白對照，在紫外分光光度計(jì)200～600 nm波長下掃描，結(jié)果顯示根皮苷對照品及供試品均在286 nm波長處有最大吸收，故選擇286 nm作為測定波長。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。在285 nm處測定吸光度，以甲醇為空白對照。以根皮苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度A為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.042 3X+0.001 5(r=0.999 0)，表明根皮苷質(zhì)量濃度在4.0～20.0 μg·mL-1與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.4.2 精密度試驗(yàn) 對同一份對照品溶液，連續(xù)測定吸光度6次。經(jīng)計(jì)算根皮苷的RSD=0.30%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對同一供試品溶液(HY-9)在第0，1，2，4，8，12 h依法測定吸光度，計(jì)算根皮苷的RSD=1.26%(n=6)，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6份樣品(HY-9)細(xì)粉，各約0.1 g，照2.1.2項(xiàng)下的方法制備供試液，測定吸光度，經(jīng)計(jì)算根皮苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.01%，RSD=2.65%(n=6)，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.1.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取俄色葉藥材細(xì)粉約0.1 g(HY-9)，共6份，分別加入10 mg的根皮苷對照品，照2.1.2項(xiàng)下的方法制備供試液，測定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 俄色葉中根皮苷加樣回收試驗(yàn)

2.1.5 樣品中根皮苷的測定 精密稱取俄色葉樣品0.1 g(過5號篩)，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定其吸光度，計(jì)算根皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。

2.2 根皮素含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0.04%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0～10 min，22% A；10～20 min，22%～30% A；20～30 min，30% A；30～50 min，30%～50% A；50～55 min，50%～22% A。流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量為5 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為286 nm。理論板數(shù)按根皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。對照品及供試品溶液色譜圖見圖2。

表3 不同產(chǎn)地及不同采收時(shí)間俄色葉中根皮苷、根皮素的測定(n=3)

A.根皮素對照品 B.變?nèi)~海棠(BY-4) C.花葉海棠(HY-9)圖2 根皮素對照品及俄色葉供試品HPLC圖

2.2.2 對照品溶液的制備 取根皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入40%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲提取30 min，靜置，用40%乙醇補(bǔ)足減失的重量，離心，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液2，5，10，20，30 μL注入液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，以質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=17.735 5X+5.297，r=0.999 9，表明根皮素質(zhì)量濃度在17.26～252.0 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(BY-4)，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)行測定，測得其峰面積，經(jīng)計(jì)算根皮素的RSD=2.2%，表明供試品液室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測得其峰面積，經(jīng)計(jì)算根皮素的RSD=0.64%，表明該儀器精密度良好。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取俄色葉樣品(BY-4)5份，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1色譜條件測得其峰面積，經(jīng)計(jì)算根皮素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%，RSD=3.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取俄色葉藥材細(xì)粉約0.25 g(BY-4)，共6份，分別加入1 mL根皮素對照品溶液(0.4 mg·mL-1)，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1色譜條件測定根皮素含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 俄色葉中根皮素加樣回收試驗(yàn)

注：根皮素對照品加入量均為400 μg

2.2.5 樣品中根皮素的測定 精密稱取俄色葉樣品0.5 g(過5號篩)，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1色譜條件測定峰面積，計(jì)算根皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。

3 結(jié)論與討論

3.1 含量測定方法

課題組前期對俄色葉的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，表明該藥含大量的黃酮類成分，并對其進(jìn)行了提取分離，得到根皮素和根皮苷單體。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HPLC初步測定俄色葉不同提取溶劑中根皮苷、根皮素含量，根皮苷以甲醇為提取溶劑最佳，根皮素則以40%乙醇提取溶劑最佳。由于根皮苷的含量高，是根皮素的幾十倍，無法同時(shí)測定，但根皮素抗氧化活性高，是根皮苷的幾十倍[16-17]，而且以甲醇作為提取溶劑中根皮素含量只有以40%乙醇作為提取溶劑的1/17，因此采用紫外-可見分光光度法所測定甲醇提取液中根皮苷含量受根皮素含量的影響極小，故本研究采用HPLC進(jìn)行根皮素(C15H14O5)的含量測定，而根皮苷(C24H24O10)含量測定則采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行。

3.2 流動(dòng)相的選擇

分別考察了不同比例甲醇-水和乙腈-水的流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈-水能獲得較好的分離效果，但根皮素與之相鄰的峰有時(shí)呈肩峰或一個(gè)峰的形式存在，在考察梯度洗脫程序中發(fā)現(xiàn)增加10 min的30%乙腈進(jìn)行洗脫，效果最好，且分離度良好，兩個(gè)峰的出峰時(shí)間間隔長。

3.3 小結(jié)

俄色葉中根皮苷平均含量為22.11%，根皮素平均含量為0.51%，其中變?nèi)~海棠的根皮苷平均含量為21.05%，根皮素平均含量為0.47%；花葉海棠的根皮苷平均含量為23.26%，根皮素平均含量為0.55%?；ㄈ~海棠的根皮苷、根皮素含量均比變?nèi)~海棠略高。在對比不同葉片大小方面，以小葉藥材中的根皮苷、根皮素含量最高，且明顯高于大葉藥材。

本研究所建立的方法，穩(wěn)定性、重復(fù)性及回收率好，結(jié)果可靠，可以準(zhǔn)確、快捷地測定俄色葉中根皮苷和根皮素的含量。

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QuantificationAnalysisofPhloridzin，PhloretininTibetanMedicine“Eseye”

XIADongmei1，2，3，LIMin1，2，3*，WANGDaoqing1，2，3，YANGBingyue1，2，3，JINGYong1，2，3

(1.CollegeofPharmacy，ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu611137，China；2.TheMinistryofEducationKeyLaboratoryofStandardizationofChineseHerbalMedicine，Chengdu611137，China； 3.StateKeyLaboratoryBreedingBaseofSystematicResearch，DevelopmentandUtilizationofChineseMedicineResources，Chengdu611137，China)

Objective：In the present study，the methods were established for detection and quantification analysis of phloridzin，phloretin in tibetan medicine “Eseye”.Methods：Phloridzin was extracted with methanol and determinated by UV.Phloretin was extracted by 40% ethanol and determinated by HPLC.Mobile phase was acetonitrile and 0.04% phosphoric acid with gradient elute.Flow rate was 1 mL·min-1.Detection wavelength was 286 nm.Column temperature was 30℃.Results：The maximum absorption wavelength of phloridzin is the same as “Eseye” extract.In this chromatographic conditions，the chromatographic peak of phloretin with other chromatographic peak can be achieved baseline separation，the method has good reproducibility，and the average recovery was 102.6%，RSD was 2.61%(n=6).This method determined phloridzin and phloretin in “Eseye”(19 batches)For the frist time，the average determination of phloridzin is 22.11%，and phloretin is 0.51%.Conclusion：This method can determine the content of phloridzin and phloretin in “Eseye” quickly and accurately.It can be used as a reference for quality evaluation，and provide theoretical basis for the exploitation and utilization of tibetan medicine “Eseye”.

Eseye；Phloridzin；Phloretin；Quantification analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.08.004

2014-02-28)

第四次全國中藥資源普查(2012-H-100)，2013年四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)制定

*

李敏，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥品種、質(zhì)量及資源；E-mail：028limin@163.com