6種長鏈脂肪酸對(duì)瘤胃微生物體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

經(jīng)語佳 高 健 鄭亞洲 王夢(mèng)芝

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

反芻動(dòng)物瘤胃對(duì)養(yǎng)分的消化吸收以及微生物發(fā)酵可產(chǎn)生大量的揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，而VFA對(duì)反芻動(dòng)物營養(yǎng)代謝和其瘤胃功能存在著重要的影響，且不同種類VFA對(duì)反芻動(dòng)物生理作用不同，飼糧中添加脂肪酸可以影響瘤胃微生物區(qū)系及其發(fā)酵的過程，引起VFA濃度及比例的變化。VFA是有機(jī)物質(zhì)在瘤胃中發(fā)酵的主要產(chǎn)物，可以為反芻動(dòng)物提供70% ～80%的可消化能［1-2］，并且通過VFA代謝為瘤胃消化吸收提供大部分能量［3］。同時(shí)，VFA的產(chǎn)生可以使瘤胃保持一個(gè)較為理想的酸性環(huán)境，利于瘤胃微生物的生長與繁殖，再通過瘤胃微生物對(duì)飼糧進(jìn)行發(fā)酵，從而形成瘤胃環(huán)境的良性循環(huán)［4］。另外，VFA作為結(jié)腸厭氧菌對(duì)飼糧纖維、未消化淀粉等物質(zhì)降解、酵解的終產(chǎn)物，易被結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞吸收，為結(jié)腸黏膜提供能源，具有刺激結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖和黏膜生長、增加腸系膜血流和胃腸激素分泌等生理作用。由此可見，VFA在改善反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能中有重要意義。研究表明，油脂在瘤胃中降解產(chǎn)生的不飽和鍵能抑制原蟲［5］、部分菌群［6］的生長及原蟲對(duì)細(xì)菌的吞噬［7］，進(jìn)而可能通過改變瘤胃微生物的群體結(jié)構(gòu)而影響瘤胃的發(fā)酵。Ramesh等［8］也報(bào)道不同脂肪酸對(duì)瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸和丙酸濃度的影響具有一定的差異。但目前對(duì)于脂肪酸影響瘤胃內(nèi)環(huán)境及特定微生物區(qū)系等的研究鮮見報(bào)道。為此，本研究選取6種不同種類的長鏈脂肪酸，旨在研究其對(duì)瘤胃微生物體外發(fā)酵產(chǎn)生的VFA濃度的影響，并且為進(jìn)一步研究脂肪酸對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生態(tài)機(jī)理的影響提供試驗(yàn)參考和部分理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在2013年3月至2013年5月期間進(jìn)行。在揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)選取3頭1.5周歲、體重(29.4±2.7)kg、裝有永久性瘤胃瘺管的山羊，單圈飼養(yǎng)，以玉米+豆粕+羊草為常規(guī)飼糧，每日按體重的2.5%干物質(zhì)量供料，07:00和19:00分2次等量飼喂，自由飲水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與培養(yǎng)底物

試驗(yàn)分為添加3%硬脂酸(A組)、油酸(B組)、亞油酸(C組)、α-亞麻酸(D組)、花生四烯酸(E組)、二十碳五烯酸(F組)的試驗(yàn)組和添加3%棕櫚酸鈣的對(duì)照組，每組各設(shè)3個(gè)重復(fù)，另外設(shè)1個(gè)無底物的空白對(duì)照。培養(yǎng)底物組成見表1。

表1 培養(yǎng)底物組成Table 1 Composition of culture substrates %

1.3 體外培養(yǎng)與樣品采集

1.3.1 瘤胃液的采集

通過瘤胃瘺管，利用自制真空負(fù)壓裝置，在晨飼前從3只瘺管羊的瘤胃中各采集瘤胃液500 mL，過4層紗布，濾液裝于事先通有CO2并39℃預(yù)熱的滅菌生理鹽水瓶中，將3只羊瘤胃液混合均勻，39℃水浴保溫迅速送回實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 體外培養(yǎng)

體外培養(yǎng)參照Menke等［9］的方法。配制培養(yǎng)液(人工唾液鹽∶瘤胃液 =2∶1)，通入 CO2，39 ℃水浴預(yù)熱。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)編號(hào)三角瓶并滅菌30 min，并準(zhǔn)確稱取各組1.95 g底物置于培養(yǎng)瓶中，分別加入200 mL培養(yǎng)液。通入CO2，39℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)。

分別在培養(yǎng)后 0、3、6、9、12、18、24 h 取樣，每次取2 mL，并-20℃冷凍保存，用于培養(yǎng)液VFA濃度的測(cè)定。

1.4 培養(yǎng)液VFA濃度測(cè)定

采用日本島津GC-14B氣相色譜儀參考文獻(xiàn)［10］的方法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件:毛細(xì)管柱CP-WAX(長30 m，內(nèi)徑0.53 mm，膜厚1μm);氣化室溫度200℃，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)溫度200℃;柱溫采用程序升溫法，初溫100℃，末溫150℃，升溫速率3℃/min，靈敏度為101，衰減為25，以巴豆酸為內(nèi)標(biāo)物。培養(yǎng)液處理:培養(yǎng)液經(jīng)15 000×g離心10 min后取上清液1 mL加0.2 mL 20%含60 mmol/L巴豆酸的偏磷酸，混勻后高速離心取上清液0.4μL進(jìn)樣分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS v16.0軟件中compare mean的oneway ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)總VFA濃度的影響

由表2可知，各組總VFA濃度總體上都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其時(shí)間點(diǎn)平均值由0 h的38.97 mmol/L上升至24 h的117.03 mmol/L，并以D組在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)在較高水平波動(dòng)，而對(duì)照組在相對(duì)較低的水平波動(dòng)?？俈FA濃度平均值D組最高，為 91.24 mmol/L;對(duì)照組最低，為78.47 mmol/L。

0、9、12、24 h 時(shí)，總 VFA 濃度組間差異不顯著(P＞0.05);3 h時(shí)，D組總VFA濃度顯著高于A、B、C和對(duì)照組(P＜0.05)，但與 E和 F組間差異不顯著(P＞0.05);6 h時(shí)，D組總VFA濃度顯著高于A組和對(duì)照組(P＜0.05)，但與B、C、E、F組間差異不顯著(P＞0.05);18 h時(shí)，D組總VFA濃度顯著高于A、B、E、F組和對(duì)照組(P＜0.05)，但與C組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)乙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響

由表3可知，乙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比總體上呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)后期有上升的趨勢(shì)，數(shù)值在62.87% ～69.74%間變動(dòng)。

表2 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)總VFA濃度的影響Table 2 Effects of different kinds of long-chain fatty acids on total VFA concentration mmol/L

0、3、6、12、24 h 時(shí)，乙酸在總 VFA 中的摩爾濃度百分比組間差異皆不顯著(P＞0.05);9 h時(shí)，D組乙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比顯著高于B和F組(P＜0.05)，但與A、C、E組和對(duì)照組間差異不顯著(P＞0.05);18 h時(shí)，D組乙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比顯著高于F組(P＜0.05)，但與A、B、C、E組和對(duì)照組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)丙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響

由表4可知，丙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比總體上呈現(xiàn)上升、下降、再上升和再下降的波動(dòng)變化趨勢(shì)，數(shù)值在20.86% ～25.83%間變動(dòng)。

在各采樣時(shí)間點(diǎn)，丙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比組間差異皆不顯著(P＞0.05)。

表3 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)乙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響Table 3 Effects of different kinds of long-chain fatty acids on acetate molar concentration percentage in total VFA %

表4 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)丙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響Table 4 Effects of different kinds of long-chain fatty acids on propionate molar concentration percentage in total VFA %

2.4 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)乙酸/丙酸的影響

由表5可知，乙酸/丙酸總體上呈現(xiàn)下降、上升、再下降和再上升的波動(dòng)變化趨勢(shì)，數(shù)值在2.48～3.34間變動(dòng)。試驗(yàn)各組乙酸/丙酸平均值以A、D組及對(duì)照組較高。0 h平均值較高，為3.19，培養(yǎng)3 h后下降為2.67，之后在2.66～2.79間變動(dòng)。

6 h時(shí)，A組和對(duì)照組乙酸/丙酸顯著高于B和C組(P＜0.05)，其他組間差異不顯著(P＞0.05);其他時(shí)間點(diǎn)，乙酸/丙酸組間差異皆不顯著(P＞0.05)。

2.5 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響

由表6可知，丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比總體上呈現(xiàn)下降、上升再下降的趨勢(shì)，數(shù)值在7.62%～13.08%間變動(dòng)。

0、12、24 h時(shí)，丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比組間差異皆不顯著(P＞0.05);3和6 h時(shí)，D組丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比顯著低于A組(P＜0.05)，但與其他組間差異皆不顯著(P＞0.05);9 h時(shí)，D組丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比顯著低于B組(P＜0.05)，但與其他組間差異皆不顯著(P＞0.05);18 h時(shí)，D組丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比顯著低于F組和對(duì)照組(P＜0.05)，但與其他組間差異皆不顯著(P＞0.05)。

表5 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)乙酸/丙酸的影響Table 5 Effects of different kinds of long-chain fatty acids on acetate/propionate

表6 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響Table 6 Effects of different kinds of long-chain fatty acids on butyrate molar concentration percentage in total VFA%

3 討論

3.1 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)總VFA濃度的影響

本研究結(jié)果表明，添加不同種類的長鏈脂肪酸后，培養(yǎng)液中總VFA濃度均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且0～6 h之間總VFA濃度增長速度較快，6 h后增長速度減緩，這可能與瘤胃微生物的活性有關(guān)，符合微生物的生長繁殖規(guī)律，即微生物在指數(shù)生長期之后，生長速度趨于平穩(wěn)，然后進(jìn)入衰亡期［11-12］。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組總VFA濃度均高于對(duì)照組，其中以α-亞麻酸組持續(xù)在較高的水平(平均值為91.24 mmol/L)波動(dòng)，且在部分時(shí)間點(diǎn)與其他組間有顯著差異，說明3%水平的α-亞麻酸有較好地促進(jìn)發(fā)酵的效應(yīng)。這可能由于游離脂肪酸中的不飽和鍵能抑制瘤胃原蟲的生長繁殖［13］，并抑制原蟲對(duì)瘤胃細(xì)菌的吞噬，從而提高了微生物的生物總量和其群體的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)了瘤胃的發(fā)酵。而不同組間發(fā)酵效果的差異，可能和游離脂肪酸的不飽和程度有關(guān)。本試驗(yàn)添加3%的油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸，相當(dāng)于在培養(yǎng)體系中分別添加了相應(yīng)的脂肪酸 0.212、0.214、0.216、0.198、0.198 mmol。上述各種不飽和脂肪酸的不飽和度依次增大(分別含有 1、2、3、4、5 個(gè)不飽和鍵)，但本試驗(yàn)結(jié)果表明處于中等量的α-亞麻酸組的總VFA濃度較其他組高，提示一定量的不飽和脂肪酸通過對(duì)微生物的調(diào)控促進(jìn)了培養(yǎng)液的發(fā)酵;而不飽和程度更多的花生四烯酸和二十碳五烯酸可能是對(duì)微生物的負(fù)面作用大于通過抑制原蟲提高細(xì)菌的正面作用，從而提示該添加水平致使微生物細(xì)胞的損害程度較大，而其適宜的添加水平有待進(jìn)一步的研究。

3.2 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)乙酸/丙酸的影響

乙酸和丙酸均能在反芻動(dòng)物代謝過程中提供能量，且丙酸發(fā)酵產(chǎn)生的能量較多，乙酸/丙酸過高會(huì)影響能量的利用效率［14］;過低則會(huì)影響奶牛牛奶的乳脂率［15］。由本試驗(yàn)結(jié)果可看出，0～3 h內(nèi)，乙酸/丁酸均呈下降趨勢(shì)，而丙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比則呈上升趨勢(shì)。這可能是由于原蟲發(fā)酵的主要終產(chǎn)物是乙酸和丁酸，產(chǎn)生丙酸的濃度很低［16］，而不飽和脂肪酸抑制瘤胃原蟲，使原蟲數(shù)量減少，導(dǎo)致了乙酸、丁酸產(chǎn)生量和乙酸/丙酸的下降。本試驗(yàn)中3～6 h和9～12 h間的乙酸/丙酸的回升和波動(dòng)，則可能和不飽和脂肪酸對(duì)原蟲抑制作用的持續(xù)時(shí)間和效果有關(guān)，也可能和瘤胃微生物的生長周期有關(guān)。Chalupa等［17］也曾報(bào)道，飼糧中添加10%不飽和脂肪酸能降低乙酸/丙酸。另外也有試驗(yàn)表明，飼糧中添加脂肪會(huì)降低乙酸濃度，增加丙酸濃度，使乙酸/丙酸降低［18-19］;張春梅等［20］利用瘤胃模擬體外產(chǎn)氣法研究添加亞麻酸對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響試驗(yàn)中，亞麻油組的乙酸/丙酸顯著低于對(duì)照組。以上研究與本試驗(yàn)結(jié)果皆有一定的一致性。但本試驗(yàn)中，各組乙酸/丙酸的變化趨勢(shì)總體上不存在顯著差異，綜合總VFA濃度的結(jié)果表明，本試驗(yàn)3%的脂肪酸添加水平促進(jìn)了微生物發(fā)酵，但沒有顯著改變乙酸/丙酸模式。

3.3 不同種類長鏈脂肪酸對(duì)丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響

丁酸由反芻動(dòng)物瘤胃中微生物發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生，瘤胃內(nèi)生成的丁酸大部分經(jīng)瘤胃和網(wǎng)胃壁吸收。丁酸在經(jīng)瘤、網(wǎng)胃壁吸收的過程中，大部分轉(zhuǎn)變?yōu)橥w，生成的酮體80%以上是β-羥丁酸，其余是乙酰乙酸和丙酮。β-羥丁酸可在骨骼肌和心肌中氧化，也可用于脂肪組織和乳腺的脂肪酸合成。丁酸還是上皮細(xì)胞的能量來源，可以促進(jìn)胃腸道細(xì)胞的增殖和成熟［21］，并對(duì)啟動(dòng)瘤胃發(fā)育起首要作用［22］。丁酸同時(shí)還抑制乙酸和丙酸在瘤胃上皮中的激活，使瘤胃上皮優(yōu)先利用丁酸，減少了對(duì)乙酸的代謝量。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比波動(dòng)變化，其中α-亞麻酸組明顯低于其他組，且 3、6、9、18 h時(shí)與其他組差異顯著。這說明3%的α-亞麻酸對(duì)瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生丁酸有一定的抑制作用。這和上述的原蟲的代謝終產(chǎn)物是乙酸和丁酸，而該組可能對(duì)原蟲的抑制作用較強(qiáng)有關(guān)。綜合總VFA濃度在該組最高而丁酸比例較低的結(jié)果表明，3%的α-亞麻酸可能通過抑制原蟲繁殖，促進(jìn)細(xì)菌繁殖，進(jìn)而促進(jìn)瘤胃微生物的發(fā)酵。我們將進(jìn)一步研究培養(yǎng)液中瘤胃原蟲、瘤胃細(xì)菌的生物量和其群體結(jié)構(gòu)等，以闡明脂肪酸影響微生物發(fā)酵的機(jī)理。另外，由于本試驗(yàn)采用精粗比為60∶40的培養(yǎng)底物，這與目前反芻動(dòng)物生產(chǎn)中多使用的偏粗型飼糧有一定的差異，因此還需進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)來驗(yàn)證生產(chǎn)中是否能達(dá)到預(yù)期的效果。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，培養(yǎng)液中添加3%不同種類的長鏈脂肪酸對(duì)總VFA濃度存在一定的調(diào)控作用。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，各組乙酸/丙酸總體上呈現(xiàn)下降、上升、再下降和再上升的波動(dòng)變化趨勢(shì);以α-亞麻酸促進(jìn)瘤胃微生物發(fā)酵，提高總VFA濃度效果較好。

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