延胡索酸二鈉對氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵甲烷及揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量的影響

牛文靜 趙廣永 張婷婷 鄭文思

(中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

反芻動物瘤胃內(nèi)生成的甲烷(CH4)以噯氣的形式釋放到大氣中。一方面，CH4能占攝入飼料總能的2% ～15%，瘤胃中CH4的產(chǎn)生降低了飼料能量的利用效率［1］;另一方面，CH4是溫室氣體。反芻動物產(chǎn)生的CH4大約占釋放到大氣中CH4總量的15%，其對地球溫室效應的影響占所有影響因素的15% ～20%［2］。因此，減少反芻動物 CH4產(chǎn)量不僅有利于提高反芻動物對飼料能量的利用效率，而且也有利于緩解地球的溫室效應。

稻草是我國重要的粗飼料資源。稻草的粗纖維含量高，粗蛋白質(zhì)含量低，適口性差，消化率低。反芻動物對未加工處理稻草的消化率一般僅為50%左右。秸稈氨化技術(shù)經(jīng)濟實用，簡單易行。研究表明，利用尿素對稻草進行氨化處理，能夠提高稻草的粗蛋白質(zhì)含量，降低粗纖維含量，提高干物質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的瘤胃降解率［3］。李兵等［4］研究結(jié)果顯示，隨著尿素水平的提高，氨化稻草的可消化性提高，但瘤胃發(fā)酵的CH4產(chǎn)量也同時提高。如何應用氨化技術(shù)，在提高反芻動物對稻草的消化率的同時，使氨化稻草在瘤胃發(fā)酵過程中的CH4產(chǎn)量不增加或減少，是應該用秸稈氨化技術(shù)面臨的重要問題。

延胡索酸是生物體三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，延胡索酸還原菌能夠把延胡索酸還原成琥珀酸，進一步形成丙酸［5］。延胡索酸二鈉(disodium fumarate，DF)是有效的氫氣(H2)受體，能夠促進丙酸生成，降低CH4產(chǎn)量［6］。因而，延胡索酸有利于降低瘤胃 CH4的產(chǎn)量。López等［7］研究表明，延胡索酸二鈉能夠降低CH4產(chǎn)量，提高飼料干物質(zhì)消化率。Carro等［8］研究表明，延胡索酸二鈉能夠提高體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)產(chǎn)量，降低 CH4產(chǎn)量。Wood等［9］研究結(jié)果顯示，進行包被處理的延胡索酸能夠降低瘤胃發(fā)酵CH4產(chǎn)量。本試驗擬研究延胡索酸二鈉對氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵CH4和VFA產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗稻草氨化處理

以使用0(未處理)、4%、6%的尿素氨化處理的稻草作為飼料樣品。氨化稻草的制作按照李兵等［4］的方法進行:稱取1 kg風干稻草，切短至2 cm左右;將40 g尿素溶解于400 mL自來水，配制成10%(質(zhì)量體積比 )的尿素溶液。量取40 mL 10%的尿素溶液，均勻噴灑在100 g稻草上，使尿素溶液與秸稈混合均勻，制備4%尿素處理的氨化稻草。量取60 mL 10%的尿素溶液，均勻噴灑在100 g稻草上，制備6%尿素處理的氨化稻草。將稻草裝入廣口瓶，每個處理分別使用10個廣口瓶，每個瓶為1個重復。將廣口瓶密封，保存在避光處28 d。環(huán)境平均溫度為21.4℃(7.8～31.3℃)。氨化過程完成后，取出稻草，制備成風干樣品，粉碎過1 mm網(wǎng)篩備用。

1.1.2 延胡索酸二鈉

延胡索酸二鈉，相對分子質(zhì)量160.04，分析純，純度98%。

1.2 試驗設計

試驗采用3×5雙因素設計，即3個［0(未處理)、4%、6%］尿素水平氨化處理稻草和體外發(fā)酵液中5個(0、2%、4%、8%、12%)延胡索酸二鈉添加水平。每個處理設置10個重復，每批發(fā)酵樣品設置3個空白。

1.3 瘤胃液供體動物及其飼糧

選用2頭體況良好，體重相近，安裝永久性瘤胃瘺管，平均體重約為550 kg的西門塔爾牛作為瘤胃液供體。試驗牛的飼糧包括精飼料2.0 kg/d，粗飼料7.0 kg/d。精飼料組成為:玉米58%、豆粕20%、小麥麩18%、碳酸氫鈣2%、食鹽1%、微量元素預混料1%。粗飼料為干羊草。每天將飼糧分為相等的2份，分別在07:00和17:00喂牛。瘤胃液供體牛拴系飼養(yǎng)，自由飲水。飼喂15 d后，第16天時開始采集瘤胃液。

1.4 試驗方法

采用 Menke等［10］的體外產(chǎn)氣法進行發(fā)酵。使用內(nèi)徑為32 mm、長200 mm、體積最大刻度為100 mL的玻璃注射器作為發(fā)酵器。使用能夠準確控溫的生化培養(yǎng)箱(SHP-150，上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司)作為控溫裝置。

1.4.1 緩沖液的配制方法［10］

緩沖液 A:稱取 CaCl2·2H2O 13.2 g、MnCl2·4H2O 10.0 g、CoCl2·6H2O 1.0 g 和FeCl3·6H2O 8.0 g，溶解于100 mL蒸餾水中。緩沖液B:稱取NaHCO335 g和 NH4HCO34 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中。緩沖液C:稱取Na2HPO45.7 g、KH2PO46.2 g 和 MgSO4·7H2O 0.6 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中。

還原劑溶液:將4 mL 1 mol/L NaOH和625 mg Na2S·9H2O添加于95 mL蒸餾水中，制備成溶液，混合均勻。還原劑溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

緩沖液的混合順序為:400 mL蒸餾水、0.1 mL緩沖液A、200 mL緩沖液 B、200 mL緩沖液C、40 mL還原劑溶液。

1.4.2 瘤胃液采集與發(fā)酵液的配制

在早晨飼喂后2 h，分別從2頭供體牛的瘤胃中采取瘤胃液250 mL，經(jīng)4層紗布過濾、混勻后放入保溫瓶中，迅速帶回實驗室，測定其pH。將瘤胃液與混合緩沖液以1∶2的體積比例裝入試劑瓶中，混合均勻，置于39℃水浴恒溫箱中保溫，并持續(xù)通入二氧化碳(CO2)。

1.4.3 體外瘤胃發(fā)酵

分別稱取0.200 0 g左右的風干稻草樣品，放入每個注射器內(nèi)。根據(jù)試驗設計，分別向注射器中添加相應水平的延胡索酸二鈉。每個注射器內(nèi)吸取30 mL發(fā)酵液，排空注射器內(nèi)的氣體，密封針頭，記錄注射器活塞的位置，放入39℃生化培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵。

鑒于秸稈飼料樣品進行體外發(fā)酵45～52 h，秸稈的體外消化率和產(chǎn)氣量達到最高［11-12］，本試驗進行48 h的體外發(fā)酵。在發(fā)酵結(jié)束時，記錄注射器活塞的位置，以計算發(fā)酵過程中的總產(chǎn)氣量，并收集氣體和發(fā)酵液待測。

1.5 指標測定與分析

1.5.1 總產(chǎn)氣量

樣品總產(chǎn)氣量為試驗處理注射器48 h總產(chǎn)氣量與空白處理注射器48 h總產(chǎn)氣量之差。

1.5.2 CH4、CO2和 H2產(chǎn)量

利用氣相色譜儀(TP-2060T，北京北分天普儀器技術(shù)有限公司)測定氣體樣品中的CH4、CO2和H2產(chǎn)量。

1.5.3 VFA產(chǎn)量

發(fā)酵結(jié)束后，采集5 mL發(fā)酵液，裝入50 mL離心管內(nèi)，在15 000×g下離心15 min。準確吸取上清液1 mL于2 mL離心管中，并加入250μL 25%(質(zhì)量體積比)的偏磷酸溶液充分混合，在15 000×g下再次離心15 min，吸取2μL上清液，應用氣相色譜儀測定VFA產(chǎn)量。

1.5.4 計算公式

式中:Y樣品為樣品48 h產(chǎn)氣量(mL/g)或VFA產(chǎn)量(μmol/g);Y試驗為試驗處理發(fā)酵液48 h產(chǎn)氣量(mL/g)或 VFA 產(chǎn)量(μmol/g);Y空白為空白處理48 h產(chǎn)氣量(mL/g)或VFA產(chǎn)量(μmol/g);DM為樣品干物質(zhì)含量(g)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應用SAS 9.0統(tǒng)計分析軟件的one-way ANOVA對各處理的數(shù)據(jù)進行方差分析，差異顯著者采用Duncan氏法進行多重比較。統(tǒng)計分析模型為:

式中:Yij表示觀測值;μ表示所有觀測值的平均值;αi表示尿素氨化稻草第i水平的處理效果(i=1、2、3);βj表示延胡索酸二鈉第 j水平的處理效果(j=1、2、3、4、5、6);εij表示隨機誤差。

2 結(jié)果

2.1 延胡索酸二鈉對氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

從表1可以看出，延胡索酸二鈉提高了未處理和氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵的總產(chǎn)氣量和CO2產(chǎn)量，其中2%延胡索酸二鈉顯著提高了未處理稻草的總產(chǎn)氣量(P＜0.05)，12%延胡索酸二鈉顯著提高了6%尿素氨化稻草的總產(chǎn)氣量(P＜0.05)。12%延胡索酸二鈉顯著降低了4%尿素氨化稻草的H2產(chǎn)量(P＜0.05)。延胡索酸二鈉降低了CH4/總產(chǎn)氣量和CH4/總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)，其中8%和12%延胡索酸二鈉顯著降低了4%尿素氨化稻草的CH4/總產(chǎn)氣量(P＜0.05)，12%延胡索酸二鈉顯著降低了6%尿素氨化稻草的CH4/總產(chǎn)氣量(P＜0.05)，2%、4%、8%和12%延胡索酸二鈉顯著降低了未處理稻草的CH4/TVFA(P＜0.05)，12%延胡索酸二鈉顯著降低了4%尿素稻草的CH4/TVFA(P＜0.05)。

隨尿素水平的提高，稻草的總產(chǎn)氣量和CO2產(chǎn)量顯著提高(P＜0.05)，CH4/總產(chǎn)氣量和CH4/TVFA顯著下降(P＜0.05)，但其他指標沒有顯著變化(P＞0.05)。

尿素水平對各指標均存在顯著影響(P＜0.05)，延胡索酸二鈉添加水平對除H2產(chǎn)量外的各指標影響均顯著(P＜0.05)，尿素和延胡索酸二鈉對總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量、CH4/總產(chǎn)氣量、CH4/TVFA均存在顯著的交互作用(P＜0.05)。

2.2 延胡索酸二鈉對氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵VFA產(chǎn)量的影響

從表2可以看出，延胡索酸二鈉降低了未處理和氨化稻草的乙酸/丙酸，其中2%、4%、8%和12%的延胡索酸二鈉顯著降低了未處理和6%尿素氨化稻草乙酸/丙酸(P＜0.05)，8%和12%的延胡索酸二鈉顯著降低了4%尿素氨化稻草乙酸/丙酸(P＜0.05)。延胡索酸二鈉提高了丙酸產(chǎn)量，其中，8%和12%的延胡索酸二鈉顯著提高了未處理和4%尿素氨化稻草的丙酸產(chǎn)量?？傮w上，延胡索酸二鈉能夠降低乙酸和丁酸產(chǎn)量，僅8%延胡索酸二鈉顯著降低了6%尿素氨化稻草的乙酸產(chǎn)量(P＜0.05)，2%、4%、8%和12%的延胡索酸二鈉僅顯著降低了6%尿素氨化稻草的丁酸產(chǎn)量(P＜0.05)。TVFA產(chǎn)量未呈現(xiàn)一致性規(guī)律。

隨著尿素水平的提高，TVFA、乙酸、丙酸和丁酸的產(chǎn)量顯著提高(P＜0.05)。

尿素水平對除丁酸/TVFA外的各指標均存在顯著影響(P＜0.05)，延胡索酸二鈉添加水平對除TVFA產(chǎn)量外的各指標均存在顯著影響(P＜0.05)，但是二者僅對乙酸、丙酸和TVFA產(chǎn)量的影響存在顯著交互作用(P＜0.05)。

3 討論

3.1 延胡索酸二鈉對氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

López等［7］的體外發(fā)酵試驗表明，延胡索酸二鈉添加水平為5～10 mmol/L時，提高了飼糧的總產(chǎn)氣量，降低了CH4產(chǎn)量，對H2產(chǎn)量沒有顯著影響。Carro等［8］報道，延胡索酸二鈉添加水平為4～10 mmol/L時，降低了飼糧體外發(fā)酵的CH4產(chǎn)量，但對總產(chǎn)氣量沒有影響。本試驗向每個注射器發(fā)酵液中添加的延胡索酸二鈉水平分別為0、0.83、1.67、3.33、5.01 mmol/L。結(jié)果顯示，延胡索酸二鈉能夠顯著提高未處理和氨化稻草體外發(fā)酵的總產(chǎn)氣量和CO2產(chǎn)量，沒有降低CH4的絕對產(chǎn)量，但是能夠顯著降低其相對產(chǎn)量，即CH4/總產(chǎn)氣量和CH4/TVFA。本試驗結(jié)果與上述報道一致?？偖a(chǎn)氣量是衡量飼料可消化性的重要指標。延胡索酸二鈉提高了未處理和氨化稻草總產(chǎn)氣量，說明延胡索酸二鈉有促進纖維素消化的作用［6］。延胡索酸二鈉降低了未處理以及4%和6%尿素氨化稻草CH4相對產(chǎn)量的原因，可能是延胡索酸二鈉促進了延胡索酸還原菌的生長，從而與產(chǎn) CH4菌競爭 H2，減少了 CH4的相對產(chǎn)量［5］。這說明，延胡索酸二鈉不僅能夠降低飼糧的CH4產(chǎn)量，而且也能夠降低未處理和氨化稻草瘤胃發(fā)酵CH4的相對產(chǎn)量。

表1 延胡索酸二鈉對氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響(干物質(zhì)基礎)Table 1 Effects of DF on gas production of ammoniated rice straw after in vitro rumen fermentation(DM basis)

3.2 延胡索酸二鈉對氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵VFA產(chǎn)量的影響

López等［7］應用自由采食苜蓿干草并補飼300 g精飼料的綿羊瘤胃液對飼糧進行體外發(fā)酵，結(jié)果顯示，延胡索酸二鈉提高了乙酸和丙酸的產(chǎn)量。Carro等［8］的研究也顯示，延胡索酸二鈉提高了飼糧體外發(fā)酵乙酸、丙酸和TVFA的產(chǎn)量，降低了乙酸/丙酸。本試驗結(jié)果表明，延胡索酸二鈉能夠顯著降低未處理和氨化稻草的乙酸/丙酸，顯著提高丙酸產(chǎn)量，顯著降低乙酸和丁酸產(chǎn)量。與前者結(jié)果一致。這說明，延胡索酸二鈉是有效的H2受體，能夠促進丙酸生成，降低CH4產(chǎn)量［6］。

一般情況下，粗飼料在瘤胃中發(fā)酵的乙酸產(chǎn)量顯著高于丙酸產(chǎn)量。但粗飼料在瘤胃中發(fā)酵的乙酸和丙酸實際產(chǎn)量與粗飼料的結(jié)構(gòu)性碳水化合物(纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠)和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(淀粉、可溶性糖)的含量及其可發(fā)酵程度密切相關。本試驗結(jié)果顯示，稻草發(fā)酵的乙酸產(chǎn)量僅略高于丙酸產(chǎn)量。這可能是由于稻草是低質(zhì)粗飼料，其結(jié)構(gòu)性碳水化合物可發(fā)酵程度較低。

在生產(chǎn)實踐中，使用未處理和氨化稻草飼喂反芻動物時，可通過向飼糧中添加適量的延胡索酸二鈉抑制瘤胃中CH4的產(chǎn)生，但仍需要應用動物試驗研究確定在不同飼糧條件下延胡索酸二鈉的適宜添加水平。

4 結(jié)論

延胡索酸二鈉提高了未處理和氨化稻草體外發(fā)酵的總產(chǎn)氣量，降低了乙酸/丙酸和CH4的相對產(chǎn)量，可用于未處理和氨化稻草瘤胃CH4減排。

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