飼料中添加不飽和脂肪酸對刀鱭幼魚脂肪代謝酶活性和肌肉成分的影響

魏廣蓮 徐鋼春 顧若波， 徐 跑，*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，無錫 214081;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，無錫 214081)

魚油富含不飽和脂肪酸(UFA)，特別是包括二十碳五烯酸(EPA，C20∶5n-3)與二十二碳六烯酸(DHA，C22∶6n-3)在內(nèi)的多不飽和脂肪酸(PUFA)。適量的添加魚油可以滿足魚類對脂肪酸的需求，通過多種途徑來調(diào)控機(jī)體的生長發(fā)育、脂質(zhì)代謝、免疫功能等，維持魚類良好的生長效果［1-2］。因此，富含PUFA的魚油一直以來都被作為魚類飼料優(yōu)質(zhì)的脂肪源［3-4］。研究表明，星斑川鰈(Platichthys stellatus)幼魚增重率同飼料中n-3高不飽和脂肪酸(HUFA)含量呈折線關(guān)系，隨著飼料n-3 HUFA含量的增加，增重率明顯上升［5］;影響黃鱔增重率和增長率的第一限制因子為亞麻酸(LNA，C18∶3n-3)，其次是亞油酸(CLA，C18∶2n-6)和 EPA+DHA［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中EPA+DHA含量的逐漸增加，黃顙魚的增重率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，各飼料組的黃顙魚增重率差異較大;當(dāng)每100 g飼料中EPA+DHA含量為2.324 g時，黃顙魚的增重率最高［8］。周萌等［9］試驗結(jié)果顯示，隨著飼料中n-3/n-6脂肪酸比值的降低，軍曹魚血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性以及膽固醇含量均呈現(xiàn)不同程度地下降，表明適宜的n-3/n-6脂肪酸比值對軍曹魚營養(yǎng)性脂肪酸的形成具有調(diào)控作用。馬晶晶等［10］研究表明，黑鯛幼魚肝體比及腹脂率隨飼料中n-3 HUFA含量的增加而減小，肌肉脂肪含量受n-3 HUFA的影響顯著，在n-3 HUFA含量為0.88%時達(dá)到最低，飼料中n-3 HUFA通過同步調(diào)控脂肪合成與分解2個過程影響黑鯛幼魚脂肪代謝，具體表現(xiàn)為:黑鯛幼魚肝臟脂肪酸合成酶活性及基因表達(dá)水平均在n-3 HUFA含量＞0.92%時有顯著下降;腹腔脂肪激素敏感脂肪酶活性及基因表達(dá)水平均隨飼料中n-3 HUFA含量的增加呈升高趨勢。

刀鱭(Coilia nasus)，隸屬鯡形目(Clupeiformes)鳀科(Engraulidae)鱭屬(Coilia)，體長側(cè)扁，為肉食性動物。其脂肪豐富，味道鮮美，一直被奉為席上珍品，是享有“長江三鮮”美譽(yù)之一的名貴洄游性魚類。刀鱭人工養(yǎng)殖目前處于初期探索階段［11-13］，飼料研究剛剛起步，關(guān)于飼料UFA水平對刀鱭脂肪代謝酶活性和肌肉成分影響的研究尚未見報道。本試驗在刀鱭幼魚馴食飼料成功的基礎(chǔ)上，根據(jù)實際情況，選用配合飼料作為對照，并以富含UFA的魚油為添加源，初步研究添加UFA對刀鱭幼魚脂肪代謝酶活性和肌肉成分的影響，以期為進(jìn)一步探討刀鱭脂肪代謝調(diào)控機(jī)制以及后期配合飼料中適宜的脂肪酸添加量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以常見的一種干粉飼料進(jìn)行試驗，主要原料為魚粉、淀粉、魚汁粉、酵母、膨化大豆等，粗蛋白質(zhì)水平固定在24%左右，UFA添加源為飼料精制魚油，配制不添加(飼料1)和添加4.76%魚油(飼料2)的2種試驗飼料，試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。將粉狀配合飼料與水分以3∶2(質(zhì)量比)均勻混合，并經(jīng)16目篩網(wǎng)過濾后制成軟顆粒飼料［7-8，14］。使用前測定2種試驗飼料的主要營養(yǎng)成分(表1)和脂肪酸組成(表2)。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(濕重基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(wet weight basis) %

1.2 試驗用魚及飼養(yǎng)管理

試驗用魚于2012年9月4日采捕于長江靖江段，飼養(yǎng)在淡水漁業(yè)研究中心宜興基地室內(nèi)水泥池(規(guī)格:700 cm×435 cm×120 cm)中。試驗前人工馴化20 d使其攝食人工飼料。刀鱭幼魚始體質(zhì)量(2.78±0.09)g，體長(9.50±0.51)cm，隨機(jī)分配到6個水泥池中，每個水泥池500尾，隨機(jī)分為2組，每組3個重復(fù)。2組試驗魚投喂不同的試驗飼料，每天分別于08:00、14:00各投喂1次。試驗期間平均水溫(22.5±1.5)℃，pH 8.0～8.4，亞硝酸鹽≤0.2 mg/L，溶解氧≥6.0 mg/L，鹽度0.45～0.60，氨氮≤0.02 mg/L。飼養(yǎng)時間60 d，飼養(yǎng)結(jié)束后經(jīng)統(tǒng)計計算，2組試驗魚的存活率均達(dá)96%。

表2 魚油及試驗飼料的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of fish oil and experiment diets %

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 形體指標(biāo)測定

飼養(yǎng)60 d后，每池隨機(jī)抽取9尾魚分別稱體質(zhì)量，量體長、體厚;在低溫下進(jìn)行解剖，取肌肉、內(nèi)臟、肝臟等，濾紙吸干后，分別稱內(nèi)臟、肝臟質(zhì)量，用于計算肝體指數(shù)(hepatosomatic index，HSI)、臟體指數(shù)(viserosomatic index，VSI)和肥滿度(condition factor，CF)。稱重后-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。計算公式如?

式中:Wb(g)為每尾魚試驗?zāi)w質(zhì)量;Wh(g)為每尾魚試驗?zāi)└闻K質(zhì)量;Wv(g)為每尾魚試驗?zāi)﹥?nèi)臟質(zhì)量;L(cm)為每尾魚試驗?zāi)w長。

1.3.2 脂肪代謝相關(guān)酶活性及脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量測定

將肝臟和肌肉樣本解凍后用4℃生理鹽水按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9比例稀釋進(jìn)行冰浴勻漿，制成 10%勻漿液，4℃，2 000 r/min離心10 min，上清液保存于-20℃冰箱。肝臟中脂肪酶(LPS)活性、LPO含量和總脂酶(TLP，包括脂蛋白脂酶和肝脂酶)活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定;肝臟和肌肉中肉堿軟脂酰基轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ(CPT-Ⅰ)活性采用CPT-Ⅰ定量檢測試劑盒［酶聯(lián)免疫吸附法［(ELISA)］測定;肉堿軟脂?；D(zhuǎn)移酶-Ⅱ(CPT-Ⅱ)活性采用CPT-Ⅱ定量檢測試劑盒(ELISA)測定;乙酰輔酶A羧化酶(ACC)活性用ACC定量檢測試劑盒(ELISA)測定，上述試劑盒均購自上海江萊生物技術(shù)有限公司。肝臟和肌肉組織中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定。

1.3.3 基本營養(yǎng)成分測定

參照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定，水分含量采用105℃烘干法(GB 5009.3—2003)測定;粗灰分含量采用馬福爐560℃灼燒法(GB 5009.4—2003)測定;粗蛋白質(zhì)含量采用微量凱氏定氮法(GB 5009.5—2003)測定;粗脂肪含量采用全脂肪法(GB 5009.6—2003)測定。

1.3.4 肌肉脂肪酸組成測定

刀鱭幼魚肌肉中脂肪酸組成測定采用面積歸一化法(GB/T 5009.168—2003)使用Agilent 6890型氣相色譜儀測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)錄入Excel 2007做初步處理，再用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，用LSD多重比較分析試驗結(jié)果的差異顯著性，顯著性水平為P＜0.05，結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 2組刀鱭幼魚形體指標(biāo)的差異

由表3可知，2組刀鱭幼魚的末均質(zhì)量、末體長、體長/體高、體長/體厚、HSI及VSI均沒有顯著差異(P＞0.05)，但飼料2組刀鱭幼魚的CF顯著高于飼料1組(P＜0.05)。

表3 2組刀鱭幼魚形體指標(biāo)的比較Table 3 Comparison of body indices of two groups of juvenile Coilia nasus

2.2 2組刀鱭幼魚肌肉基本營養(yǎng)成分的差異

由表4可知，飼料1組刀鱭幼魚肌肉中粗蛋白質(zhì)含量顯著高于飼料2組(P＜0.05)，達(dá)到179.03 mg/g，其粗灰分含量也高于飼料2組，但二者差異不顯著(P＞0.05);飼料2組刀鱭幼魚肌肉中粗脂肪含量高于飼料1組，但二者差異不顯著(P＞0.05);2組刀鱭幼魚肌肉中水分和干物質(zhì)含量相當(dāng)(P＞0.05)。

2.3 2組刀鱭幼魚脂肪代謝相關(guān)酶活性及LPO含量的差異

由表5可知，2組刀鱭幼魚肝臟中LPS和TLP活性及LPO含量均差異不顯著(P＞0.05)。飼料1組刀鱭幼魚肝臟中LPS和TLP活性高于飼料2組，但飼料2組刀鱭幼魚肝臟中LPO含量則高于飼料1組，且達(dá)到飼料1組的2.5倍。肝臟中，飼料1組刀鱭幼魚CPT-Ⅰ和CPT-Ⅱ活性顯著高于飼料2組(P＜0.05)，而ACC活性低于飼料2組(P＞0.05);肌肉中，2組刀鱭幼魚 CPT-Ⅰ、CPT-Ⅱ以及ACC活性均無顯著差異(P＞0.05)，但是從數(shù)值上看，飼料1組刀鱭幼魚的CPT-Ⅰ和ACC活性高于飼料2組，CPT-Ⅱ活性低于飼料2組。

表4 2組刀鱭幼魚肌肉基本營養(yǎng)成分比較(濕重基礎(chǔ))Table 4 Comparison of common nutritional components in muscle of two groups of juvenile Coilia nasus(wet weight basis) mg/g

表5 2組刀鱭幼魚不同組織中脂肪代謝相關(guān)酶活性及LPO含量的比較Table 5 Comparison of fat metabolism related enzyme activities and LPO content in different tissues of two groups of juvenile Coilia nasus

2.4 2組刀鱭幼魚肌肉脂肪酸組成的差異

由表6可知，2組刀鱭幼魚肌肉中都測得飽和脂肪酸(SFA)6種，單不飽和脂肪酸(MUFA)6種，PUFA 10種。飼料添加4.76%的魚油后，肌肉中SFA和MUFA含量下降，PUFA含量上升。飼料1組刀鱭幼魚肌肉中SFA(33.1%)和MUFA含量(47.5%)顯著高于飼料2組(P＜0.05);飼料2組刀鱭幼魚肌肉中PUFA含量顯著高于飼料1組(P＜0.05);飼料2組的EPA+DHA含量(12.6%)顯著高于飼料1組(P＜0.05)，幾乎是飼料1組的2倍;飼料2組的n-3 PUFA含量顯著高于飼料1組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 飼料中添加UFA對刀鱭幼魚形體指標(biāo)的影響

魚類的CF、HSI和VSI等指標(biāo)可以很好的顯示出魚體健康狀況和品質(zhì)優(yōu)良性，CF值大表明魚體肥度較好，VSI小表明魚體可食用部分的比例高［15］。從本試驗結(jié)果可知，2組刀鱭幼魚的CF存在顯著差異，以飼料2組刀鱭幼魚魚體的肥度較好，這可能與飼料2中添加魚油有關(guān)。楊鳶劼等［6］研究結(jié)果顯示，影響黃鱔 CF的主要因子是C18∶2n-6，而對肝體指數(shù)產(chǎn)生一定影響的則是EPA+DHA;劉波等［16］關(guān)于翹嘴紅鲌投喂高脂飼料的研究表明，隨著飼料中脂肪水平升高，魚體HSI和 VSI均有升高;張春暖等［17］也發(fā)現(xiàn)梭魚VSI與脂肪添加量呈正相關(guān);此外，還有試驗發(fā)現(xiàn)添加魚油飼料會造成魚體肝臟受損，出現(xiàn)不同程度的發(fā)白、發(fā)黃現(xiàn)象［15］。然而，本試驗中添加UFA的飼料2組刀鱭幼魚HSI與飼料1組沒有顯著差異，只是略低于飼料1組，且解剖時肝臟鮮紅，未發(fā)現(xiàn)異常狀況。

表6 2組刀鱭幼魚肌肉脂肪酸組成的比較Table 6 Comparison of fatty acid composition in muscle of two groups of juvenile Coilia nasus %

3.2 飼料中添加UFA對刀鱭幼魚脂肪代謝相關(guān)酶活性的影響

UFA性質(zhì)不穩(wěn)定，很容易氧化，會產(chǎn)生有細(xì)胞毒性的LPO。TLP包括脂蛋白脂酶和肝脂酶，主要催化甘油三酯水解，在脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用［18-19］。本試驗中，飼料1組刀鱭幼魚的肝臟中LPS和TLP活性均高于飼料2組，而飼料2組刀鱭幼魚肝臟中LPO含量高于飼料1組，說明添加UFA后刀鱭幼魚體內(nèi)LPO含量升高，這可能會對魚體肝臟細(xì)胞造成損傷。飼料中脂肪含量過度會造成魚體內(nèi)脂肪惡意蓄積，對魚體的增重、形體及脂肪沉積會產(chǎn)生負(fù)作用，所以要研究出刀鱭幼魚飼料中UFA的最適宜添加量，還需要做不同梯度水平的相關(guān)研究試驗。從解剖來看，飼料2組刀鱭肝臟沒有異常情況，但是長時間飼養(yǎng)是否有害則有待進(jìn)一步深入研究。

肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是脂肪分解過程中的重要組成部分CPT-Ⅰ和CPT-Ⅱ是肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的重要組成酶，也是脂肪分解的限速酶，是脂肪酸吸收的限制因素。ACC可以催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，參加脂肪酸合成中二碳單位的供體提供過程并具有酯解作用。本試驗中，飼料2的PUFA及EPA+DHA含量比飼料1高，有利于魚體內(nèi)脂肪酸的合成，所以飼料2組刀鱭幼魚相關(guān)合成酶含量較高，這與飼料2組刀鱭幼魚肝臟內(nèi)ACC活性高于飼料1組相符。本試驗還發(fā)現(xiàn)，機(jī)體脂肪代謝酶與魚體CF密切相關(guān)，這與張媛媛等［15］對異育銀鯽的研究結(jié)果相符合。飼料1組刀鱭幼魚肝臟中脂肪合成的限速酶ACC活性低于飼料2組，脂肪分解的限速酶CPT-Ⅰ和CPT-Ⅱ活性則均高于飼料2組，說明飼料1組刀鱭幼魚脂肪酶分解速度快，魚體內(nèi)沒有過多的脂肪沉積，這與其CF顯著低于飼料2組相符。肌肉中的CPT-Ⅰ和CPT-Ⅱ以及ACC活性與肝臟中的規(guī)律并不相同，飼料1組刀鱭幼魚肌肉中脂肪合成的限速酶ACC活性反而比飼料2組高，其原因有待進(jìn)一步的研究。

3.3 飼料中添加UFA對刀鱭幼魚肌肉基本營養(yǎng)成分和脂肪酸組成的影響

魚體肌肉中的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分是肌肉基本的營養(yǎng)組成成分。粗蛋白質(zhì)含量可以衡量肌肉的營養(yǎng)價值，粗脂肪含量可以衡量魚體脂肪積累量，粗灰分含量可以評價出魚骨的軟硬［20］。這些是評判刀鱭品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。本試驗中，飼料中添加UFA后最明顯的特點就是刀鱭幼魚肌肉中粗蛋白質(zhì)含量顯著下降，粗脂肪含量有升高趨勢。

刀鱭肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，不可排除這與其體內(nèi)豐富的n-3 HUFA有關(guān)［21］。n-3 HUFA包括EPA和DHA，一般認(rèn)為具有相當(dāng)高的營養(yǎng)價值，對人體新陳代謝具有重要生理功能。本試驗中，2組刀鱭幼魚肌肉中都測得22種脂肪酸，其中6種SFA，6種MUFA，10 種 PUFA，與劉凱等［22］測得的刀鱭脂肪酸種類相近。有研究表明，飼料高脂肪含量可提高虹鱒(Oncorhynchus mykiss)魚體脂肪的含量;但是，又有研究發(fā)現(xiàn)大菱鲆(Scophthalmus maximus)肌肉中脂肪含量受飼料脂肪含量影響不顯著［23-24］。本試驗中，飼料添加4.76%的魚油后，隨著飼料中的MUFA和n-3 HUFA含量的增加，飼料2組刀鱭幼魚體內(nèi)PUFA及EPA+DHA含量有顯著升高，說明提高飼料中UFA含量可以有效的增加魚體必需脂肪酸含量，有利于提高魚體的營養(yǎng)價值。

4 結(jié)論

提高飼料中UFA含量可有效地增加刀鱭幼魚魚體必需脂肪酸含量，有利于改善魚體的營養(yǎng)品質(zhì)，但有升高魚體內(nèi)毒害物質(zhì)LPO含量的趨勢。

致謝:

感謝江南大學(xué)食品學(xué)院唐雪副教授在本試驗過程中給予的幫助和指導(dǎo)!

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