鄒 云 謝紅兵 禹琪芳 李江長(zhǎng) 何紹平 賀建華
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128)
植物多糖是國際上公認(rèn)的天然優(yōu)良的免疫調(diào)節(jié)劑、生物活性多糖或免疫活性多糖等[1]。牛膝多 糖 (Achyranthes bidentata polysaccharides,ABP)、白術(shù)多糖(Atractylodes macrocephalaon polysaccharides,AMP)和黃芪多糖(Astragalus polysaccharides,AP)因具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、保護(hù)腸道、修復(fù)組織和提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的一系列作用,逐漸成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),ABP能促進(jìn)仔豬血清淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors,TNF)、白細(xì)胞介素 -1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素 -2(interleukin-2,IL-2)、白細(xì)胞介素 -6(interleukin-6,IL-6)、分泌[2]。朱南山等[3]試驗(yàn)表明 AMP對(duì)仔豬血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子均能產(chǎn)生積極的影響。Liu等[4]研究發(fā)現(xiàn)AP能誘導(dǎo)脾臟樹突狀細(xì)胞分化,促使輔助性 T細(xì)胞2(helper T cell 2,TH2)向輔助性T細(xì)胞1(helper T cell 1,TH1)轉(zhuǎn)化,從而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞免疫功能。但以前的試驗(yàn)多集中在單一多糖的研究上,對(duì)不同多糖之間效果的比較及幾種多糖的聯(lián)合使用很少見。為此,本文就3種多糖在相同條件下單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血清細(xì)胞因子含量的影響進(jìn)行研究,為闡明3種多糖對(duì)仔豬免疫調(diào)控的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。
選用256頭28日齡的杜長(zhǎng)大(杜洛克×長(zhǎng)白×大白,Duroc×Landrace×Yorkshire)斷奶仔豬,采用3因素2水平(2×2×2)試驗(yàn)設(shè)計(jì),按體重相近原則隨機(jī)分為8個(gè)處理,每個(gè)處理4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)8頭仔豬,ABP、AMP、AP添加水平分別為0、800 mg/kg。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1,處理1(即對(duì)照組)飼喂基礎(chǔ)飼糧,處理2~8(即試驗(yàn)組)飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加不同水平多糖的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)第14天和第28天09:00每重復(fù)隨機(jī)挑選1頭豬,無菌前腔靜脈采血,分別注入真空肝素鈉抗凝管和真空管制成抗凝血和血清。采用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF、干擾素 - γ(interferon-γ,IFN-γ)含量。
表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design mg/kg
試驗(yàn)多糖來源于西安天園生物制劑廠,ABP由果糖和葡萄糖組成,AMP主要成分為甘露聚糖和果聚糖,AP由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成。ABP、AMP、AP 有效含量分別為 60%、60% 和65%,折算后純的3種多糖添加到飼糧中的量為800 mg/kg。
參照NRC(1998)仔豬營養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn),并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐配制基礎(chǔ)飼糧,其組成及營養(yǎng)水平見表2。
動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)在湖南省益陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所沅江豬場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行,采取自由采食、飲水,免疫消毒程序按豬場(chǎng)常規(guī)方法進(jìn)行。
1.5.1 仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)定
淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)采用MTT法,應(yīng)用非特異性有絲分裂原植物血凝素(PHA)作為刺激物。具體操作參照何昭陽等[5]的測(cè)定方法。取新鮮抗凝血1 mL,與全血稀釋液1∶1混勻后,小心加于4 mL淋巴細(xì)胞分離液液面之上,以2 500 r/min離心15 min,吸出位于血漿層下的白膜層,用3~5倍體積無小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗2次,每次以2 000 r/min離心10 min,用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),活細(xì)胞在95%以上,用含10%小牛血清RPMI 1640完全培養(yǎng)液配成3×106個(gè)/mL單細(xì)胞懸液。置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)后丟棄貼壁的單核細(xì)胞,獲得外周血淋巴細(xì)胞,并配成2×106個(gè)/mL淋巴細(xì)胞懸液。用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng),試驗(yàn)孔每孔加入2×106個(gè)/mL淋巴細(xì)胞懸液100μL和 PHA 液 100 μL,PHA 終 濃 度 為25μg/mL,對(duì)照孔每孔加入淋巴細(xì)胞懸液100μL和RPMI 1640培養(yǎng)液100μL,每個(gè)處理設(shè)5個(gè)觀察值,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)44 h,接著每孔加入5 mg/mL MTT溶液20μL,繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),小心棄去各孔上清液,再每孔加入150μL二甲基亞砜,在微型振蕩器上震蕩10 min,使MTT充分溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)每孔OD570nm值。以刺激指數(shù)(stimulation indices,SI)值高低反映淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低,其計(jì)算公式為:SI=PHA刺激孔OD平均值/對(duì)照孔OD平均值。
表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %
1.5.2 仔豬血清細(xì)胞因子含量的測(cè)定
采用ELISA試劑盒測(cè)定血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ 的含量,按照試劑盒說明書中的方法和步驟進(jìn)行測(cè)定。試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件的GLM過程進(jìn)行析因分析,試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
由表3可知,試驗(yàn)處理對(duì)試驗(yàn)第14天和第28天時(shí)斷奶仔豬的外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率有顯著影響(P<0.05),與對(duì)照組相比,單獨(dú)或聯(lián)合添加多糖組斷奶仔豬的外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率都顯著提高(P <0.05)。試驗(yàn)第14天時(shí),ABP、AMP、AP兩兩合用較單獨(dú)添加ABP或者AMP有提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的趨勢(shì),但差異不顯著(P>0.05),AMP與AP或ABP合用較單獨(dú)添加AP有顯著提高(P <0.05)。試驗(yàn)第28天時(shí),ABP、AMP、AP兩兩合用較單獨(dú)添加1種多糖的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率有所提高,但差異也不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)第14天和第28天時(shí),3種多糖合用時(shí)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于單獨(dú)添加1種多糖(P<0.05),較兩兩合用組有不同程度提高(P>0.05)。試驗(yàn)第28天各組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與試驗(yàn)第14天相比均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。析因分析表明,ABP、AMP、AP極顯著提高了斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(P<0.01),3種多糖兩兩或三者合用對(duì)斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率有提高趨勢(shì)(P>0.05),但相互之間未體現(xiàn)出互作效應(yīng)(P>0.05)。
2.2.1 ABP、AMP、AP對(duì)試驗(yàn)第14天斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量的影響
由表4可知,試驗(yàn)第14天時(shí),添加多糖組斷奶仔豬血清細(xì)胞因子 IL-2、IL-1β、TNF、IFN-γ 的含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),IL-6的含量有一定程度提高,但單獨(dú)添加1種多糖時(shí)與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05),只有兩兩合用或三者合用時(shí)才顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。ABP、AMP、AP兩兩合用較單獨(dú)添加其中1種多糖的細(xì)胞因子IL-6含量有顯著提高(P <0.05),對(duì) IL-1β、IL-2、TNF 有不同程度提高,但差異不顯著(P>0.05)。3種多糖兩兩合用較單獨(dú)添加AP或AMP可顯著提高IFN-γ含量(P<0.05)。3種多糖合用時(shí)細(xì)胞因子IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ 的含量顯著高于單獨(dú)添加 1種多糖(P<0.05),較兩兩合用有不同程度提高。析因分析表明,ABP極顯著提高了試驗(yàn)第14天斷奶仔豬細(xì)胞因子 IL-2、IL-1β、IL-6、TNF、IFN-γ 的含量(P<0.01)。AP極顯著提高了試驗(yàn)第14天斷奶仔豬細(xì)胞因子 IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ 的含量(P<0.01),顯著提高了IL-1β含量(P<0.05)。AMP極顯著提高了試驗(yàn)第14天斷奶仔豬細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、TNF、IFN-γ 的含量(P < 0.01),顯著提高了IL-2含量(P<0.05)。聯(lián)合使用3種多糖對(duì)提高斷奶仔豬血清IL-6含量具有極顯著的互作效應(yīng)(P <0.01),但對(duì)提高IL-2、IL-1β、TNF、IFN-γ含量相互之間未體現(xiàn)出互作效應(yīng)(P>0.05)。
表3 ABP、AMP、AP對(duì)斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響Table 3 Effects of ABP,AMP and AP on lymphocyte proliferation in peripheral blood of weaner piglets
2.2.2 ABP、AMP、AP對(duì)試驗(yàn)第28天斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量的影響
由表5可知,試驗(yàn)第28天時(shí),單獨(dú)或聯(lián)合添加多糖組斷奶仔豬血清的細(xì)胞因子 IL-2、IL-1β、TNF、IFN-γ的含量與對(duì)照組相比都顯著提高(P<0.05),IL-6含量有一定程度提高,但單獨(dú)添加1種多糖時(shí)與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05),僅在兩兩合用或三者合用時(shí)才顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。ABP、AMP、AP兩兩合用組較單獨(dú)添加其中1種多糖組的TNF、IL-1β、IFN-γ含量有顯著提高(P<0.05),對(duì)IL-2、IL-6含量有不同程度提高,但差異不顯著(P>0.05)。3種多糖合用組的IL-6、IL-1β、TNF、IFN-γ 的含量顯著高于單獨(dú)添加 1種多糖組(P<0.05),較兩兩合用組有不同程度提高。析因分析表明,ABP、AMP、AP極顯著提高了斷奶仔豬試驗(yàn)第28天細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF、IFN-γ的含量(P<0.01),ABP顯著提高了 IL-2含量(P<0.05)。ABP和AMP對(duì)提高斷奶仔豬試驗(yàn)第28天血清TNF含量具有極顯著的互作效應(yīng)(P<0.01)。AP和AMP對(duì)提高斷奶仔豬試驗(yàn)第28天血清IL-1β含量具有顯著的互作效應(yīng)(P<0.05)。3種多糖對(duì)提高斷奶仔豬血清IL-2、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量相互之間未體現(xiàn)出互作效應(yīng)(P>0.05)。
表4 ABP、AMP、AP對(duì)試驗(yàn)第14天斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量的影響Table 4 Effects of ABP,AMP and AP on serum cytokine contents of weaner piglets on the 14th day of the experiment
淋巴細(xì)胞增殖是反映機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一個(gè)重要指標(biāo)[6]。目前已有許多試驗(yàn)表明多糖可通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖等途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。陳清華等[2]研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加ABP可以顯著提高仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血清中TNF、IL-1β、IL-2、IL-6 等細(xì)胞因子的含量,且存在一定的量效和時(shí)效關(guān)系。李宗鍇等[7]通過體外研究表明ABP能提高老年小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖能力。李麗立等[8]研究顯示飼糧中單獨(dú)添加白術(shù)純多糖、復(fù)合粗多糖顯著提高了早期斷奶仔豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。陳洪亮等[9]研究表明AP對(duì)雛雞外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能有增強(qiáng)作用,且與對(duì)照組差異顯著。毛曉峰[10]研究表明AP顯著地提高了斷奶仔豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和IL-2的活性。范云鵬等[11]研究表明,與對(duì)照組相比,AP組能顯著促進(jìn)雞T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖。本試驗(yàn)結(jié)果表明,單獨(dú)或聯(lián)合添加多糖組斷奶仔豬的外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與對(duì)照組相比都顯著提高,3種多糖兩兩合用較單獨(dú)添加1種多糖的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率有所提高,但差異不顯著,3種多糖合用時(shí)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于單獨(dú)添加1種多糖,較兩兩合用有不同程度提高。但3種多糖相互之間未體現(xiàn)出互作效應(yīng)。這與等研究結(jié)果相類似,AP和ABP對(duì)應(yīng)激仔豬外周血淋巴細(xì)胞增殖沒有體現(xiàn)出互作效應(yīng)。這可能由于3種多糖的特性和試驗(yàn)動(dòng)物生理反應(yīng)的復(fù)雜性造成,3種多糖對(duì)斷奶仔豬是否具有互作效應(yīng)仍需進(jìn)一步研究。
表5 ABP、AMP、AP對(duì)試驗(yàn)第28天斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量的影響Table 5 Effects of ABP,AMP and AP on serum cytokine contents of weaner piglets on the 28th day of the experiment
細(xì)胞因子是由淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞以及相關(guān)免疫細(xì)胞產(chǎn)生的具有免疫調(diào)節(jié)功能的一類蛋白類物質(zhì),是免疫系統(tǒng)重要的信息分子。近年來研究發(fā)現(xiàn),多糖有促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用,其中 IL-2、IL-6、IL-1β、TNF、IFN-γ 在免疫應(yīng)答中充當(dāng)著十分重要的角色。IL-2由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,又叫T細(xì)胞生長(zhǎng)因子,具有廣譜的免疫增強(qiáng)活性。IL-6在B細(xì)胞生長(zhǎng)分化時(shí)起關(guān)鍵作用,又稱為B細(xì)胞生長(zhǎng)因子。IFN-γ主要介導(dǎo)TH1型反應(yīng),促進(jìn)IL-2分泌釋放,促進(jìn)T細(xì)胞的分化增殖。TNF能活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,提高其殺傷活性,也可增強(qiáng)T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等活性以及產(chǎn)生IL-1、IL-6等細(xì)胞因子。IL-1β能促進(jìn)胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞的活化、增殖和分化,增強(qiáng)B細(xì)胞功能以及刺激單核細(xì)胞核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNF。本試驗(yàn)測(cè)定了仔豬血清細(xì)胞因子 IL-2、IL-6、IL-1β、TNF、IFN-γ 的含量,結(jié)果顯示,試驗(yàn)第 14天和第28天,添加多糖組細(xì)胞因子 IL-2、IL-1β、TNF、IFN-γ的含量顯著高于對(duì)照組,雖然單獨(dú)添加1種多糖時(shí)IL-6含量與對(duì)照組差異不顯著,但也有一定程度提高,兩兩合用或三者合用時(shí)顯著高于對(duì)照組。這表明3種多糖單獨(dú)或聯(lián)合使用均能在一定程度上促進(jìn)仔豬細(xì)胞因子產(chǎn)生。這與近年來的一些同類研究結(jié)果基本一致:Li等[12]報(bào)道飼糧中添加純AMP顯著提高了斷奶仔豬血清中IL-1、TNF-α、INF-γ 含量;Zhuge 等[13]報(bào)道 ABP 上調(diào)了外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá);Fan等[14]研究報(bào)道添加AP顯著提高了雞血清中IFN-γ和IL-2含量;Li等[15]研究報(bào)道AP極顯著地提高了小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和血清中IL-2含量,且存在一定的量效關(guān)系;Qiu等[16]研究表明AP可有效促進(jìn)血清中 IL-2、IFN-γ 的分泌;Zhu等[17]研究表明ABP能提高老鼠血清中IFN-γ、TNF-α含量,增強(qiáng)TH1型免疫應(yīng)答來控制瘧疾的擴(kuò)散;Jin等[18]研究表明 ABPS能顯著上調(diào)老鼠脾臟 IL-6 mRNA 和 TNF-α mRNA 表達(dá)量;Guo等[19]研究表明飼糧中補(bǔ)充ABP能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放,緩解了斷奶仔豬的免疫應(yīng)激;Chen等[20]研究表明給仔豬補(bǔ)充ABP提高了肝臟、空腸黏膜和腸系膜淋巴結(jié)IL-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。由此推論,飼糧中添加ABP、AP、AMP 能提高仔豬血清中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ含量,促進(jìn)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞增殖,提高仔豬免疫性能。本試驗(yàn)中ABP、AMP、AP兩兩合用都較對(duì)照組在不同程度上提高了淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子含量,3種多糖合用在一些指標(biāo)上優(yōu)于單獨(dú)添加組,體現(xiàn)出一定的互作效應(yīng)。3種多糖聯(lián)合使用對(duì)提高試驗(yàn)第14天斷奶仔豬血清IL-6含量具有顯著的互作效應(yīng)。ABP和AMP合用對(duì)提高試驗(yàn)第28天斷奶仔豬血清TNF含量具有顯著的互作效應(yīng)。AP和AMP合用對(duì)提高試驗(yàn)第28天斷奶仔豬血清IL-1β含量具有顯著的互作效應(yīng)。但3種多糖合用在某些指標(biāo)上未能體現(xiàn)出互作效應(yīng),如在淋巴細(xì)胞增殖上并未體現(xiàn)出一定的互作效應(yīng),可能與它們的水平組合、試驗(yàn)的測(cè)定誤差等因素有關(guān),也可能因?yàn)楸敬卧囼?yàn)3種多糖水平梯度少導(dǎo)致它們之間的相互作用不能很好地體現(xiàn)。
本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),與試驗(yàn)第14天相比,第28天的斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低,并且IL-2、IFN-γ、IL-6含量也有降低趨勢(shì),這可能是因?yàn)槎嗵堑拿庖哒{(diào)節(jié)作用受時(shí)間影響,隨著時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞對(duì)多糖再次的刺激反應(yīng)下降;也可能是因?yàn)樵谠囼?yàn)前14天,仔豬處于應(yīng)激較強(qiáng),免疫機(jī)能較弱期,添加多糖能迅速發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,而試驗(yàn)第15~28天時(shí),仔豬免疫機(jī)能逐漸完善,吸收的營養(yǎng)物質(zhì)可能主要用于生長(zhǎng)。
①飼糧中單獨(dú)添加ABP、AP、AMP可以顯著提高仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血清細(xì)胞因子IL-2、IL-1β、IFN-γ 和 TNF 的含量。
②3種多糖兩兩合用或三者合用顯著提高了外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血清細(xì)胞因子IL-2、IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF 的含量。
③ABP、AP、AMP組合添加對(duì)提高斷奶仔豬血清中細(xì)胞因子的含量體現(xiàn)出一定的互作效應(yīng)。
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動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)2014年1期