李俊良 史彬林 閆素梅 金 鹿 徐元慶 李倜宇 郭祎瑋 郭曉宇
(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,呼和浩特 010018)
仔豬在斷奶時自身的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全,而斷奶將中斷其母源抗體供應,這將損傷或抑制其免疫功能,導致仔豬在斷奶后易出現(xiàn)生長緩慢、腹瀉、感染疾病及死亡率升高等仔豬斷奶綜合征[1-3]。在傳統(tǒng)的仔豬的生產(chǎn)過程中,經(jīng)常通過在飼糧中添加抗生素來促進仔豬的健康生長,然而在抗生素帶了巨大的經(jīng)濟效益的同時也引發(fā)了藥物殘留、藥物抵制等一系列嚴重的負面效應[4-5]。因此,開發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)作用、天然綠色的抗生素替代品對促進斷奶仔豬的健康生長和保障畜產(chǎn)品的安全有重要的意義。甲殼素是真菌細胞壁及蝦、蟹等節(jié)肢類動物外殼的主要成分之一。殼聚糖是由甲殼素脫乙?;玫降囊环N天然的、無毒的、可生物降解的、帶正電荷的堿性多糖[6]。研究表明,殼聚糖能夠影響動物機體內(nèi)花生四烯酸(araehidonieaeid,AA)的代謝進而可能影響機體的免疫功能。AA的代謝網(wǎng)絡是炎癥代謝網(wǎng)絡中的一個核心網(wǎng)絡[7]。在正常的生理狀態(tài),機體中AA濃度很低,當細胞膜受到各種刺激時(如炎癥、寄生蟲等),細胞膜磷脂在磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)催化作用下可以生成 AA[8-9]。AA 在體內(nèi)主要有2條代謝途徑:一是在環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)作用下最終產(chǎn)生多種前列腺素,二是在脂氧化酶(lipoxygenase,LOX)作用下最終產(chǎn)生白細胞三烯等激素類物質(zhì),而產(chǎn)物中的前列腺素E2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能:PGE2可增強單核細胞、中性粒細胞的趨化反應等;LTB4可誘導活化抑制性T細胞和自然殺傷細胞(N-K細胞)等[8-10]。Bianeo等[11]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖可以激活巨噬細胞的胞漿型磷脂酶A2(cPLA2),進而促進了AA的釋放。Usami等[12]的試驗表明殼聚糖能刺激犬多形核細胞合成并釋放PGE2和LTB4。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖對肉仔雞免疫功能的影響可能與其提高肉仔雞血清AA濃度、cPLA2活性及小腸胞內(nèi)cPLA2 mRNA表達有關[13]。盡管人們對殼聚糖影響動物機體內(nèi)AA的代謝有了初步的研究,但是有關殼聚糖對斷奶仔豬機體內(nèi)AA代謝的研究較少,且有關殼聚糖通過影響AA代謝來調(diào)節(jié)機體免疫功能的分子機理也不太清楚。為此,本試驗旨在以斷奶仔豬外周血淋巴細胞(PBLs)為研究對象,深入研究不同水平殼聚糖對斷奶仔豬PBLs中AA代謝網(wǎng)絡途徑中主要參與炎癥反應或免疫調(diào)節(jié)的介質(zhì)、關鍵控制酶及其基因表達的影響,以期為揭示殼聚糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的可能途徑和促進其在仔豬生產(chǎn)中的應用提供科學的理論依據(jù)。
試驗所用殼聚糖(食品級,CAS RN.:9012-76-4)購買于濟南海德貝海洋生物有限公司,黏度為45 mPa·s,脫乙酰度為85.09%。
試驗所用淋巴細胞采于1頭健康的28日齡斷奶的三元雜交仔豬(杜×大×長)。在無菌采血后用豬淋巴細胞分離液(天津TBD,中國)按照說明書分離淋巴細胞。血樣在800×g離心分離20 min,收集的淋巴細胞用 RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司,美國)洗滌2次。將淋巴細胞用臺盼藍染色法在光學顯微鏡進行計數(shù)后,再懸于適量的RPMI-1640完全培養(yǎng)基[100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清和25 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液]中。
調(diào)整淋巴細胞密度為1×106個細胞/mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基,接種于2個24孔板中,每孔接種量為1 mL,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。殼聚糖的添加濃度為0、40、80、160和320μg/mL,每個處理設6個重復。培養(yǎng)24 h后,每孔中加入200μL最終濃度為16μmol/mL刀豆蛋白A(Sigma公司,美國)來刺激細胞的分化。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,離心后收集上清液(800×g,在4℃下離心 10 min),凍存于 -20℃,待測定cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及 AA、PGE2和LTB4的濃度;收集細胞,凍存于-80℃,待分析cPLA2、COX-2和5-LOX mRNA的表達。
上清液中cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及AA、PGE2和LTB4的濃度采用放射免疫法測定,所用儀器為中國科技大學實業(yè)總公司生產(chǎn)的GC-911-γ-放射免疫計數(shù)器。試劑盒由北京華英生物技術研究所提供。
淋巴細胞中總RNA用RNAiso試劑盒(大連寶生物,中國)按照說明書進行提取,RNA的完整性用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析檢測;RNA的純度在多功能酶標儀(TECAN,瑞士)上用/來確定;RNA的濃度在多功能酶標儀上讀取。取適量的RNA用PrimeScript RT試劑盒(大連寶生物,中國)進行反轉(zhuǎn)錄,反應體系為10μL,其中含有0.5μL PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I、2 μL 5 × PrimeScript Buffer、0.5 μL Random 6mers、0.5 μL Oligo dT Primer和適量的無酶水;反應條件為:37℃ 15 min,85℃ 5 s。
引物用NCBI網(wǎng)站上的在線引物設計工具設計(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/index),由上海生工生物工程有限公司合成。以β-肌動蛋白(β-actin)為管家基因,對各個目的基因進行相對定量分析。各基因的引物序列見表1。
采用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(大連寶生物,中國)進行實時定量 PCR擴增。PCR反應體系為20μL,其中10μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM、0.4μL上游引物(10μmol/L)、0.4μL下游引物 (10μmol/L)、2μL的cDNA模板和7.2μL無酶水。用Bio-Rad實時定量PCR儀(Bio-Rad,美國)進行 β-actin、cPLA2、COX-2 和5-LOX基因的PCR擴增反應,反應條件為:95℃預變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,40個循環(huán)后,72℃延伸10 min。反應結(jié)束后在70~95℃繪制熔解曲線。反應過程中用無酶水作為陰性對照,基因的相對表達量用2-ΔΔCt法[14]計算。擴增產(chǎn)物經(jīng)單一熔解曲線峰進行確定后,再取5μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確定產(chǎn)物片段大小后,由上海生工生物工程有限公司進行測序來確定產(chǎn)物序列。
表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequences
所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007整理后,采用SAS 9.0軟件中回歸分析程序進行統(tǒng)計,對含不同水平殼聚糖的處理進行線性和二次回歸分析。P<0.05代表回歸關系顯著;P<0.01代表回歸關系極顯著。
由表2可知,隨著殼聚糖添加水平的升高,PBLs培養(yǎng)液中的cPLA2、COX-2和5-LOX活性及AA、PGE2和LTB4濃度呈顯著的二次曲線變化(P<0.05),且上述所有指標的最大值出現(xiàn)在殼聚糖的添加水平為80~160μg/mL時。然而,當殼聚糖的添加水平增加到320μg/mL時,以上各指標的值有不同水平的降低。這表明殼聚糖的添加水平與 cPLA2、COX-2、5-LOX 活性及 AA、PGE2、LTB4濃度之間存在二次劑量依賴關系。
由表3可知,隨著殼聚糖添加水平的升高,PBLs中cPLA2、COX-2和5-LOX mRNA的相對表達量呈顯著的二次曲線變化(P<0.05),且上述所有指標的最大值出現(xiàn)在殼聚糖的添加水平為80~160μg/mL時。然而,當殼聚糖的添加水平增加到320μg/mL時,以上各指標的值有不同水平的降低。這說明在殼聚糖的添加水平與cPLA2、COX-2和5-LOX mRNA的相對表達量之間也存在二次劑量依賴關系。
AA是機體內(nèi)一種分布最廣的、屬于n-6系列的多不飽和的必需脂肪酸。體內(nèi)大部分AA是以sn-2位置酯化的形式存在于細胞膜磷脂當中,沒有生物活性;少量AA以游離的形式存在于細胞質(zhì)和體液中,具有活性[15]。當細胞受到刺激時(如炎癥、寄生蟲等),在細胞膜cPLA2的作用下釋放AA[8-9]。cPLA2是細胞內(nèi) PLA2主要亞型,并能夠特異性水解甘油磷脂sn-2位的脂酰鍵進而產(chǎn)生大量的AA[16]。在本試驗中,殼聚糖不僅增加了斷奶仔豬PBLs培養(yǎng)液中的AA濃度,而且提高了AA的代謝關鍵酶cPLA2的活性和淋巴細胞中cPLA2 mRNA的相對表達量。此外,殼聚糖對上述指標的影響都呈現(xiàn)出一定的二次劑量依賴關系。這表明適當水平的殼聚糖可能通過提高控制AA生產(chǎn)的關鍵酶cPLA2的活性及其基因表達進而影響AA的代謝。Bianeo等[11]研究發(fā)現(xiàn)適當水平(0.01% ~0.05%)的殼聚糖,可以顯著促進巨噬細胞釋放AA,而高水平(>0.05%)的殼聚糖沒有使AA發(fā)生顯著變化,并認為殼聚糖激活了cPLA2從而促進巨噬細胞釋放AA。程富勝等[17]報道蕨麻多糖能夠影響小鼠淋巴細胞AA代謝水平從而影響了機體免疫機能。李慧英等[13]研究指出,殼聚糖可以顯著提高肉仔雞血清中AA濃度、cPLA2活性及小腸胞內(nèi)cPLA2 mRNA的表達。本試驗的結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致。試驗中PBLs中AA濃度的升高可能是由于殼聚糖激活了PBLs中cPLA2 mRNA的表達引起cPLA2活性升高所致。
表2 殼聚糖對斷奶仔豬PBLs培養(yǎng)液中cPLA2、COX-2和5-LOX活性及AA、PGE2和LTB4濃度的影響Table 2 Effects of chitosan on cPLA2,COX-2 and 5-LOX activities and AA,PGE2 and LTB4 concentrations in PBLs medium of weaner piglets
表3 殼聚糖對斷奶仔豬PBLs培養(yǎng)液中cPLA2、COX-2和5-LOX基因表達的影響Table 3 Effects of chitosan on the expressions of cPLA2,COX-2 and 5-LOX genes in PBLs medium of weaner piglets
AA在體內(nèi)主要有2條代謝途徑:一是在COX作用下先生成不穩(wěn)定的環(huán)內(nèi)過氧化物前列腺素G2(PGG2)和前列腺素H2(PGH2),PGH2在PGE酶的催化下生成PGE2和血栓素A2;二是在5-LOX作用下,生成5-羥基過氧化二十碳四烯酸,接下來被氧化成白三烯A4和5-羥基二十碳四烯酸,白三烯A4可以進一步生成LTB4等激素類物質(zhì),AA及其代謝產(chǎn)物具有參與細胞免疫和炎癥反應等重要的生理功能[8-10,15]。在本試驗中,隨著殼聚糖添加水平的升高,PBLs培養(yǎng)液中的COX-2和5-LOX的活性及PGE2和LTB4濃度呈現(xiàn)顯著的二次曲線升高;與之對應的 PBLs中COX-2和5-LOX的mRNA相對表達量也呈現(xiàn)顯著的二次曲線升高。這表明殼聚糖不僅影響AA的產(chǎn)生,而且還可以影響AA的COX和LOX代謝途徑的代謝產(chǎn)物、關鍵酶及其基因表達。Usami等[12]報道殼聚糖能夠刺激犬多形核細胞合成并釋放PGE2和LTB4。李慧英[17]研究指出殼聚糖可以顯著提高肉仔雞血清中PGE2和LTB4的濃度。本試驗的結(jié)果表明,適量的殼聚糖可以影響AA的COX和LOX代謝途徑,這與前人的研究結(jié)果相近。AA的代謝網(wǎng)絡是炎癥反應的主要網(wǎng)絡,該網(wǎng)絡中的COX-2是環(huán)氧合酶途徑中催化AA產(chǎn)生PGE2的一種重要的誘導酶,5-LOX是脂氧化酶途徑中催化 AA 產(chǎn)生 LTB4 的關鍵酶[7,10,16]。盡管有關殼聚糖對淋巴細胞中COX-2和5-LOX的mRNA表達影響的報道較少,但本試驗的結(jié)果表明淋巴細胞上清中PGE2和LTB4濃度及COX-2和5-LOX的活性可能是由于殼聚糖提高淋巴細胞中COX-2和5-LOX的mRNA表達所致。AA的代謝產(chǎn)物中的PGE2和LTB4具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能:PGE2可增強單核細胞、中性粒細胞的趨化反應等;LTB4可誘導活化抑制性T細胞和N-K細胞等[8-10],這表明殼聚糖可能通過對AA的下游代謝途徑的影響進而發(fā)揮其對機體免疫功能的調(diào)節(jié)作用。此外,也有研究表明殼聚糖可以抑制脂多糖(LPS)所誘導的RAW264.7鼠巨噬細胞中PGE2濃度和COX-2基因表達的升高[18]。這表明殼聚糖對PGE2的產(chǎn)生具有雙向調(diào)節(jié)作用,即單獨添加殼聚糖可以促進機體PGE2的產(chǎn)生,而當在受到外界刺激時(如LPS)殼聚糖又能抑制PGE2的大量產(chǎn)生。
傳統(tǒng)上,人們認為AA及其代謝產(chǎn)物是致炎因子,然而有研究表明AA還是一個非常重要的細胞內(nèi)第二信使,參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導進而調(diào)控細胞的生物活動[15]。由此可見,AA的代謝對機體的影響是復雜多樣的,需要我們做更深入的研究來探尋其未知的、具體的功能。在本試驗中,適當水平的殼聚糖促進了斷奶仔豬PBLs內(nèi)AA代謝網(wǎng)絡途徑中參與炎癥或免疫調(diào)節(jié)的主要介質(zhì)PGE2和LTB4的產(chǎn)生,提高了關鍵控制酶cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及其基因表達。本試驗的結(jié)果也為進一步揭示殼聚糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的可能途徑和促進其在仔豬生產(chǎn)中的應用提供了一定的理論依據(jù)。
本試驗的結(jié)果表明:適當水平的殼聚糖可以促進斷奶仔豬PBLs內(nèi)AA代謝網(wǎng)絡途徑中參與炎癥或免疫調(diào)節(jié)的主要介質(zhì)PGE2和LTB4的產(chǎn)生,提高關鍵控制酶cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及其基因表達,這可能是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的原因之一。
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