飼糧蛋白質(zhì)和蛋氨酸對(duì)水貂皮膚內(nèi)毛皮發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

張海華 李光玉 常忠娟 張鐵濤 鐘 偉 周 寧孫偉麗 趙靖波 楊福合*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112;2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002)

水貂是珍貴的毛皮動(dòng)物，蛋白質(zhì)是毛皮動(dòng)物最主要的營(yíng)養(yǎng)素之一。毛發(fā)主要是角蛋白，角蛋白形成的主要來(lái)源是飼糧中的蛋白質(zhì)，因此研究飼糧中的蛋白質(zhì)對(duì)調(diào)節(jié)動(dòng)物毛絨生長(zhǎng)的作用機(jī)理，充分發(fā)揮蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)作用，從而提高毛皮動(dòng)物生產(chǎn)性能具有十分重大的意義。大量研究證明，增加飼糧中粗蛋白質(zhì)的采食量和吸收量，對(duì)于綿羊、安哥拉山羊、內(nèi)蒙古絨山羊、藍(lán)狐、安哥拉兔等毛皮動(dòng)物毛纖維的生長(zhǎng)有很大的促進(jìn)作用［1-4］。蛋白質(zhì)主要是分解為氨基酸后被動(dòng)物利用，含硫氨基酸是毛皮動(dòng)物的第一限制性氨基酸［5］，Mata等［6］研究表明，隨著飼糧中蛋氨酸含量的增加，羊毛纖維直徑、羊毛產(chǎn)量及羊的活體重量都顯著增加。Ty?pp?nen 等［7］的研究結(jié)果表明，低蛋白質(zhì)水平飼糧中補(bǔ)充蛋氨酸時(shí)，與高蛋白質(zhì)水平飼糧相比對(duì)藍(lán)狐毛皮品質(zhì)影響的差異不大。此外，Zhang等［8］和 Dahlman［9］研究表明，適當(dāng)降低藍(lán)狐飼糧蛋白質(zhì)水平，補(bǔ)充足夠量的可消化含硫氨基酸時(shí)，對(duì)冬毛期藍(lán)狐的毛皮品質(zhì)無(wú)顯著影響。因而從分子水平上來(lái)解釋蛋白質(zhì)和含硫氨基酸對(duì)水貂毛發(fā)生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)理，有助于闡明水貂在特定飼糧條件下對(duì)蛋白質(zhì)和含硫氨基酸的需要量。胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ受體(IGF-ⅠR)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)基因廣泛存在于動(dòng)物皮膚及毛囊中，在毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［10-12］。目前，關(guān)于飼糧蛋白質(zhì)水平和蛋氨酸的添加對(duì)水貂皮膚組織中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF基因表達(dá)影響的報(bào)道很少。為此，本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究飼糧中不同蛋白質(zhì)水平和蛋氨酸的添加對(duì)水貂皮膚中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF基因表達(dá)的影響，旨在闡明飼糧蛋白質(zhì)和蛋氨酸對(duì)水貂毛皮發(fā)育的作用，為蛋白質(zhì)及含硫氨基酸對(duì)毛皮發(fā)育機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用125日齡平均初始體重為(1.95±0.20)kg、身體健康的雄性水貂56只，分為4組，每組14個(gè)重復(fù)，分別為A組(飼糧蛋白質(zhì)水平為32%)、B組(飼糧蛋白質(zhì)水平為24%)、C組(飼糧蛋白質(zhì)水平為16%)和D組(飼糧蛋白質(zhì)水平為24%，同時(shí)添加0.8%DL-蛋氨酸)，試驗(yàn)預(yù)試期5 d，正試期80 d。整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)由固定飼養(yǎng)人員進(jìn)行專門的飼養(yǎng)管理。動(dòng)物每天早晚各飼喂1次，早飼喂量為全天飼糧的40%，晚飼喂量為60%，自由飲水。

1.1.2 試驗(yàn)飼糧

根據(jù)水貂常用鮮動(dòng)物性飼料原料配制不同蛋白質(zhì)水平的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.1.3 樣品采集

正試期第80天時(shí)，進(jìn)行屠宰試驗(yàn)，每組選4只體重相近的水貂取腹側(cè)部皮膚樣品，置于焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理過(guò)的凍存管中，立即放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取與檢驗(yàn)

利用總RNA提取試劑盒(Bioteke Corporation)提取水貂皮膚組織中總RNA，溶于經(jīng)DEPC處理的超純水中，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA，/O在1.8～2.0證明提取的總RNA純度符合試驗(yàn)要求。同時(shí)提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定其完整性。

1.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄

在無(wú)RNA酶污染的環(huán)境中，應(yīng)用TaKaRa試劑盒中反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，配制10μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總 RNA 1.2μL，5×PrimeScript Buffer(for Real Time)2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5μL，RNase Free dH2O 5.3 μL。將上述PCR管中的溶液混合均勻，在以下反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)，42 ℃，15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85 ℃，5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))，4℃保存，結(jié)束反應(yīng)。

1.2.3 引物合成

根據(jù) GenBank中人、鼠的 β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)序列(登錄號(hào):NM_001101.3;NM_007393.3)、IGF-Ⅰ序列(登錄號(hào):NM_000618.3;NM_001111276.1)、IGF-ⅠR 序 列(登 錄 號(hào):BC113612;NM_052807.2)和EGF序列(登錄號(hào):NM_001178130.1;NM_010113.3)，利用 DNAstar軟件找出其保守區(qū)域、利用引物分析軟件Primer 5.0分析設(shè)計(jì)其特異性引物。用β-actin作為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物詳細(xì)信息見(jiàn)表2(引物由大連寶生物公司合成)。

1.2.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，配制50μL反應(yīng)體系，10×Buffer 5μL，dNTP 4μL，上游引物(F)2 μL，下游引物(R)2 μL，cDNA 模板 2 μL，r-Taq酶0.26μL，dH2O 34.74μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，引物的復(fù)性溫度根據(jù)所有引物退火溫度范圍設(shè)置梯度，均在55～65℃，此步驟持續(xù)時(shí)間均為30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存，結(jié)束反應(yīng)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

確定好反應(yīng)溫度后，利用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)對(duì) β-actin、IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR 和EGF基因進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)體系為20 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA2μL，dH2O 6μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性 95℃、30 s;變性95℃，5 s;復(fù)性 60℃，35 s(40個(gè)循環(huán));95℃，60 s;60℃，60 s。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線及結(jié)果分析，60℃，10 s(71個(gè)循環(huán))。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets %

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物詳細(xì)信息Table 2 Detailed information of real-time fluorescence quantitative PCR primers

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)出目的基因和內(nèi)參基因，2-ΔΔCt方法分析基因相對(duì)表達(dá)差異量，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 8.0的一般線性模型(GLM)模塊進(jìn)行的單因素方差分析。表中的結(jié)果均為“平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差”(±SD)，其中 P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA及目的基因片段檢測(cè)結(jié)果

取2μL總RNA，利用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，如圖1所示。紫外分光光度計(jì)測(cè)定在1.8～2.0，表明總RNA無(wú)降解，符合試驗(yàn)純度，可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。βactin、IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR 和 EGF 基因經(jīng) 3%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)條帶與所預(yù)計(jì)的產(chǎn)物很相近，如圖2所示，各對(duì)引物PCR擴(kuò)增后的條帶清晰，無(wú)雜帶，片段大小符合引物設(shè)計(jì)要求。測(cè)序后與目的序列一致性為100%，為目的基因片段。這進(jìn)一步說(shuō)明了合成的cDNA可以用來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。

圖1 水貂皮膚總RNA電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of total RNA of mink skin

圖2 目的基因檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Result of object genes test

2.2 IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR及EGF基因在水貂皮膚組織中表達(dá)的差異

飼糧蛋白質(zhì)水平和蛋氨酸添加對(duì)水貂毛皮相關(guān)基因表達(dá)的影響見(jiàn)表3。

表3 飼糧蛋白質(zhì)水平和蛋氨酸添加對(duì)水貂毛皮相關(guān)基因表達(dá)的影響Table 3 Effects of dietary protein level and methinion supplementation on fur related gene expressions

可以看出，飼糧蛋白質(zhì)水平與中等蛋白質(zhì)水平(24%)飼糧中補(bǔ)充蛋氨酸對(duì)水貂皮膚中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF基因的相對(duì)表達(dá)量均有極顯著的影響(P＜0.01)。隨著飼糧蛋白質(zhì)水平的降低，IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，但B組和C組之間差異不顯著(P＞0.05)，當(dāng)中等蛋白質(zhì)水平飼糧中補(bǔ)充蛋氨酸(D組)后，水貂皮膚中IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著的高于B組和C組(P＜0.01)，但與A組差異不顯著(P＞0.05);水貂皮膚中EGF基因B組和C組極顯著低于A組(P＜0.01)，且中等蛋白質(zhì)水平飼糧中補(bǔ)充蛋氨酸后，水貂皮膚中EGF基因極顯著高于B組和C組(P＜0.01)，但仍極顯著低于A組(P＜0.01)。從表中可以看出，水貂皮膚中 IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和 EGF 3種基因，IGF-ⅠR的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)較高，IGF-Ⅰ和EGF的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)較低，且兩者差異不明顯。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著飼糧蛋白質(zhì)水平的提高和中等蛋白質(zhì)水平飼糧中蛋氨酸的添加，水貂皮膚中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF基因的相對(duì)表達(dá)量均有極顯著的增加趨勢(shì)。大量研究表明，在小鼠、綿羊、雞等動(dòng)物上，飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)動(dòng)物肝臟中的IGF-Ⅰ基因的相對(duì)表達(dá)量及血清中的IGF-Ⅰ含量具有顯著影響，該基因的相對(duì)表達(dá)量與飼糧蛋白質(zhì)水平呈正相關(guān)［13-16］。此外，榮風(fēng)梅等［17］研究表明，當(dāng)飼糧中添加不同水平的蛋氨酸時(shí)，隨著蛋氨酸水平的增加新西蘭肉兔肝臟組織中IGF-Ⅰ基因的相對(duì)表達(dá)量有上升的趨勢(shì)。Carew等［18］試驗(yàn)表明，8～22日齡的雄性肉雞飼糧中蛋氨酸缺乏時(shí)，對(duì)肉雞血清中IGF-Ⅰ的含量沒(méi)有顯著的影響，但I(xiàn)GF-Ⅰ基因在組織中的相對(duì)表達(dá)量會(huì)顯著降低。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，中等蛋白質(zhì)水平飼糧中添加蛋氨酸對(duì)IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF基因相對(duì)表達(dá)量有極顯著的提高作用。IGF-Ⅰ對(duì)維持和調(diào)節(jié)動(dòng)物毛發(fā)的生長(zhǎng)是必不可少的，尤其是在毛周期的初期，IGF-Ⅰ對(duì)防止毛囊過(guò)早的進(jìn)入中期具有重要的調(diào)節(jié)作用［19］。大量研究結(jié)果表明，當(dāng)提高飼糧中蛋白質(zhì)水平或蛋氨酸含量時(shí)對(duì)動(dòng)物毛絨的生長(zhǎng)有顯著的提高作用［2-3］，且外源性的 IGF-Ⅰ能夠顯著促進(jìn)體外毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)影響毛囊的形態(tài)［20-21］?？梢?jiàn)在飼糧的蛋白質(zhì)和蛋氨酸調(diào)節(jié)水貂毛絨生長(zhǎng)的過(guò)程中，IGF-Ⅰ是其發(fā)揮作用的重要信號(hào)傳導(dǎo)因子之一，或直接作用于毛囊或需要其他生長(zhǎng)因子的共同協(xié)調(diào)參與。

關(guān)于飼糧蛋白質(zhì)和蛋氨酸水平對(duì)IGF-Ⅰ及其受體基因相對(duì)表達(dá)量差異及其機(jī)制研究比較多，而對(duì)EGF基因的相對(duì)表達(dá)量研究相對(duì)較少。EGF作為一種生長(zhǎng)因子，同其他生長(zhǎng)因子一樣與飼糧中營(yíng)養(yǎng)成分有很大的相關(guān)性。Rogers等［21］年研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)激素(GH)對(duì)EGF基因的表達(dá)與生成具有重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)飼糧蛋白質(zhì)水平和蛋氨酸的添加量提高時(shí)，可以顯著地提高血液中GH的含量，飼糧中的蛋白質(zhì)和蛋氨酸水平可能通過(guò)GH來(lái)調(diào)節(jié) EGF 基因的表達(dá)［22］。Ekberg 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給大鼠外源性的GH時(shí)，可以顯著地提高大鼠肝臟中EGF及其受體基因的表達(dá)水平，而且能夠有效提高EGF與其受體的結(jié)合能力。本試驗(yàn)結(jié)果顯示隨著飼糧蛋白質(zhì)水平的下降，EGF基因的相對(duì)表達(dá)量有降低趨勢(shì)，這可能與飼糧營(yíng)養(yǎng)成分的不足而引起GH的量減少有關(guān)，但具體機(jī)理尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，EGF及其受體在成熟的毛囊中分布廣泛，主要分布在外根鞘、角朊細(xì)胞、皮脂腺和毛囊的上皮等部分［24］。姚玉園等［25］研究表明EGF對(duì)毛囊生長(zhǎng)有正向調(diào)節(jié)作用，且適當(dāng)濃度的EGF能夠顯著促進(jìn)體外毛囊生長(zhǎng)［26-27］，分析原因可能是真皮鞘細(xì)胞在一定條件下轉(zhuǎn)化為毛乳頭細(xì)胞，從而促進(jìn)了毛囊生長(zhǎng)。具體EGF基因如何調(diào)節(jié)毛絨生長(zhǎng)的機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

飼糧高蛋白質(zhì)水平和中等蛋白質(zhì)水平飼糧中蛋氨酸的添加能夠促進(jìn)水貂皮膚中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR及EGF基因的表達(dá)。

［1］BLOMSTEDT L.Pelage development in mink，ferret，and blue fox，and some influence factors［D］.Ph.D.Thesis.Finland:Department of Biosciences，University of Helsinki，1998:36.

［2］孫海洲，侯先志，紅梅.內(nèi)蒙古阿爾巴斯白絨山羊皮膚毛囊發(fā)育及其活性變化規(guī)律的研究［J］.內(nèi)蒙古畜牧科學(xué)，1998，19(4):3-6.

［3］彭玉麟，賈志海，盧德勛，等.不同蛋白質(zhì)水平的日糧對(duì)內(nèi)蒙古白絨山羊消化代謝的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，33(4):321-326.

［4］RASMUSSEN PV，B?RSTING C F.Effects of variations in dietary protein levels on hair growth and pelt quality in mink(Mustela vison)［J］.Canadian Journal of Animal Science，2000，80(4):633-642.

［5］GLEM-HANSEN N.Review of protein and amino acid requirements for mink［J］.Scientifur，1992，16(2):122-141.

［6］MATA G，MASTERS D G，BUSCALL D.Responses in wool growth，live weight，glutathione and amino acids，in Merino wethers fed increasing amounts of methionine protected from degradation in the rumen［J］.Australian Journal of Agricultural Research，1995，46(6):1189-1204.

［7］TY?PP?NEN J，BERG H，VALTONEN M.Effects of dietary supplementation of methionine and lysine onmilk parameters and fur quality in blue fox during low-protein feeding［J］.Agricultural Science in Finland，1987，59:355-360.

［8］ZHANG H H，LI G Y，LIU B Y，et al.Effects of lowprotein，DL-methionine and lysine-supplemented diets on growth performance，N-balance and fur characteristics of blue foxes(Alopex lagopus)during the growing-furring period［J］.Acta Zoonutrimenta Sinica，2010，22(6):1614-1624.

［9］DAHLMAN T.Protein and amino acids in the nutrition of the growing-furring blue fox［D］.Ph.D.Thesis.Finland:University of Helsinki，2003:33.

［10］楊淑霞，鐘志紅，秦儉，等.表皮生長(zhǎng)因子對(duì)游離毛囊生長(zhǎng)的影響［J］.中華皮膚科雜志，2000(2):99.

［11］STENN K S，PAUSR.Controls of hair follicle cycling［J］.Physiological Reviews，2001，81(1):449-494.

［12］李巖，廖和榮，李知勉，等.IGF-1對(duì)不同綿羊皮膚中5個(gè)毛囊相關(guān)生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40(3):594-600.

［13］VANDEHAAR M J，MOATS-STAATS B M，DAVENPORT M L，et al.Reduced serum concentrations of insulin-like growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ )in protein-restricted growing rats are accompanied by reduced IGF-Ⅰ mRNA levels in liver and skeletal muscle［J］.Journal of Endocrinology，1991，130(2):305-312.

［14］PELL J M，SAUNDERS J C，GILMOUR R S.Differential regulation of transcription initiation from insulinlike growth factor-Ⅰ(IGF-Ⅰ)leader exons and of tissue IGF-Ⅰexpression in response to changed growth hormone and nutritional status in sheep［J］.Journal of Endocrinology，1993，132(4):1797-1807.

［15］LAUTERIO T J，SCANES C G.The role of thyroid hormones in the growth hormone response to protein restriction in the domestic fowl(Gallus domesticus)［J］.Journal of Endocrinology，1988，117(2):223-228.

［16］ROSEBROUGH R W，MCMURTRY J P.Protein and energy relationships in the broiler chicken.Effects of protein quantity and quality on metabolism［J］.British Journal of Nutrition，1993，70:667-678.

［17］榮風(fēng)梅，譚興智.日糧中添加蛋氨酸對(duì)生長(zhǎng)肉兔肝臟中IGF-Ⅰ mRNA表達(dá)量的影響［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2010，27(9):39-41.

［18］CAREW L B，MCMURTRY J P，ALSTER F A.Effects of methionie deficiencies on plasma levels of thyroid hormones， insuline-like growth factors-Ⅰand-Ⅱ，liver and body weights，and feed intake in growing chickens［J］.Journal of Poultry Science，1987，82:1932-1938.

［19］李知勉.毛囊相關(guān)生長(zhǎng)基因的表達(dá)對(duì)綿羊毛囊生長(zhǎng)的影響［D］.碩士學(xué)位論文.石河子:石河子大學(xué)，2006.

［20］ADAMS N R，BRIEGEL J R，THOMPSON M J，et al.Metabolic hormones and tissue concentrations of mRNA for IGF-Ⅰin lines of sheep that differ in their protein synthesis response to feed intake［J］.The Journal of Endocrinology，2000，167(2):315-320.

［21］ROGERS S A，RASMUSSEN J，MILLER S B，et al.Effects of growth hormone on rat renal epidermal growth factor expression［J］.American Journal of Physiology，1994，267(2):208-214.

［22］賈斌，趙茹茜，剡根強(qiáng)，等.半胱胺對(duì)羊毛生長(zhǎng)及皮膚中GH受體、IGF-1受體和IGF-1型受體基因表達(dá)的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28(1):80-84.

［23］EKBERG S L，CARLSSON B，CARLSSON H，et al.Plasma growth hormone pattern regulates epidermal growth factor(EGF)receptor messenger ribonucleic acid levels and EGF binding in the rat liver［J］.Endocrinology，1989，125:2158-2166.

［24］WYNN P C，BROWN G，MOORE G P.Characterization and distribution of epidermal growth factor receptors in the skin and wool follicles of the sheep fetus during development［J］.Domestic Animal Endocrinology，1995，12(3):269-281.

［25］姚玉園，劉海英，袁纓，等.IGF-1和EGF對(duì)遼寧絨山羊初級(jí)毛囊體外培養(yǎng)的影響［J］.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(2):165-169.

［26］BATES E J，HYND PI，PENN N M，et al.Serum-free culture of wool folliclec:effects of nutrients growth factors and hormones［J］.British Journal of Dermatology，1997，137(4):498-505.

［27］趙宗勝，王根林，李大全，李桂芳.IGF-1和EGF對(duì)綿羊毛囊體外培養(yǎng)的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29(2):138-141.