家禽腸道屏障功能及其營(yíng)養(yǎng)調(diào)控

咼于明 劉 丹 張炳坤

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

腸道具有雙重功能，既作為消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，又是保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的先天性屏障。腸道屏障是指腸道能夠防止腸腔內(nèi)的有害物質(zhì)(如細(xì)菌和各種毒素)穿過腸黏膜進(jìn)入體內(nèi)其他組織器官和血液循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能的總和。當(dāng)腸道屏障被破壞時(shí)，腸道微生物和毒素等便可進(jìn)入血液循環(huán)，從而引起細(xì)菌和毒素的移位，易引發(fā)腸原性感染，甚至導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)或多器官功能的衰竭［1］。家禽生長(zhǎng)(尤其是早期生長(zhǎng))由于受環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激等因素的影響，很容易損傷腸道屏障，降低免疫機(jī)能，造成的腸道菌群失衡紊亂進(jìn)而引發(fā)各種疾病進(jìn)而降低其生產(chǎn)性能，甚至導(dǎo)致死亡。

1 家禽腸道屏障組成及其作用

腸道屏障是由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障和免疫屏障組成的(圖1)。4種屏障通過各自不同的分子調(diào)控機(jī)制、生物學(xué)功能以及信號(hào)通路進(jìn)行有機(jī)結(jié)合從而來(lái)共同對(duì)抗體外抗原物質(zhì)對(duì)機(jī)體的侵襲。

1.1 機(jī)械屏障

機(jī)械屏障又稱物理屏障，在腸道屏障中尤為重要，它是由腸黏膜上皮細(xì)胞及其緊密連接等組成的完整的彼此緊密連接的腸道上皮結(jié)構(gòu)［2］。家禽腸道上皮為單層柱狀上皮，包括吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和未分化細(xì)胞。吸收細(xì)胞成高柱狀排列，數(shù)量最多，相鄰細(xì)胞間有由緊密連接(tight junction)、黏著連接(adhesion junction)和橋粒(desmosome)等組成的連接復(fù)合體(圖2)，起著主要的機(jī)械屏障作用。緊密連接位于腸上皮細(xì)胞膜外側(cè)的頂部，為一狹窄的帶狀結(jié)構(gòu)(焊接線或嵴線)，其作用為封閉細(xì)胞間的間隙，阻止腸腔有毒物質(zhì)進(jìn)入周圍組織，還可起到調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞旁路的流量速度及將細(xì)胞頂部與基側(cè)膜分開的作用［3］。細(xì)胞間緊密連接的通透性決定著整個(gè)腸上皮細(xì)胞的屏障功能［4］。黏著連接位于緊密連接下方，起著細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的作用［5］。黏著連接和緊密連接(合稱為頂端連接復(fù)合體)與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相連［5-7］。橋粒起到鉚接相鄰細(xì)胞的作用［8］。

圖1 腸道屏障的組成Fig.1 Components of the intestinal barrier［9］

大約有50種蛋白質(zhì)參與緊密連接的形成，主要為閉鎖蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudins)和連接黏附分子(junctional adhesion molecule，JAM)3種完整的跨膜蛋白和閉合小環(huán)蛋白(zonula occludens，ZO)等外周胞漿蛋白。這些跨膜蛋白(occludin、claudins和JAM)的胞外域與相鄰細(xì)胞構(gòu)成選擇性屏障，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附、移動(dòng)及細(xì)胞的通透性，而胞內(nèi)域則與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的ZO(ZO-1、ZO-2和ZO-3)相連［10］。ZO是緊密連接支持結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，主要作用為連接跨膜蛋白與細(xì)胞骨架及傳遞信號(hào)分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，維持上皮的極性等［11］。claudins蛋白為緊密連接的結(jié)構(gòu)骨架，目前在哺乳動(dòng)物的claudin家族中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)24個(gè)成員，其中 claudin-1、-3、-4、-5、-8、-9、-11、-14 可使緊密連接變緊從而減小細(xì)胞旁通透性，claudin-2、-7、-12和-15則與細(xì)胞旁孔道形成相關(guān)，會(huì)使細(xì)胞旁通透性增加［12］。而在家禽中，僅見關(guān)于 claudin-1、-2、-3、-5和-16，ZO-1和-2以及occludin等緊密連接蛋白的研究報(bào)道［13-16］。此外，緊密連接與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的交互作用對(duì)緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的維護(hù)也是極其重要的。

緊密連接蛋白分子具有高度動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，其密閉程度會(huì)因外界刺激、生理和病理?xiàng)l件而發(fā)生改變［3］。為保持高度動(dòng)態(tài)狀態(tài)，緊密連接持續(xù)地受細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的監(jiān)控和調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通過磷酸化和脫磷酸化作用來(lái)控制緊密連接的裝配和拆卸，參與信號(hào)分子包括肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)、Rho 家族鳥苷三磷酸酶(Rho GTPases)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)［17］。

1.2 化學(xué)屏障

腸道化學(xué)屏障主要是由覆蓋在腸上皮細(xì)胞上的含一定數(shù)量微生物的疏松黏液外層和含少量微生物的黏液內(nèi)層組成。杯狀細(xì)胞分泌的黏液中含有細(xì)菌黏附受體的類似物——糖蛋白和糖脂，它們可改變細(xì)菌的進(jìn)攻位點(diǎn)，使細(xì)菌與糖蛋白和糖脂結(jié)合后隨糞便排出［20］。腸黏膜黏液的分泌、組成以及基因表達(dá)會(huì)受腸道微生物和宿主炎癥介質(zhì)的影響［21］。此外，腸道分泌的各種物質(zhì)，如胃酸、膽汁、消化酶、溶菌酶、糖蛋白、黏多糖和糖脂等也起到一定的化學(xué)屏障作用。胃酸能殺滅進(jìn)入胃腸道的細(xì)菌，抑制細(xì)菌在胃腸道上皮的黏附和定植。膽汁中的膽鹽和膽酸能與細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)合或直接降解內(nèi)毒素。溶菌酶可以使細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖骨架結(jié)構(gòu)斷裂，導(dǎo)致細(xì)菌裂解。腸道分泌的大量消化液通過稀釋毒素和沖洗腸腔使?jié)撛诘臈l件性致病菌難以黏附到腸上皮上。

圖2 肉雞腸上皮連接復(fù)合體Fig.2 Junctional complexes between intestinal epithelial cells of chickens

1.3 微生物屏障

腸道微生物屏障是腸道屏障的重要組成部分，可影響腸上皮的代謝和增殖。腸道微生物屏障是一個(gè)由腸道共生菌與宿主的微空間結(jié)構(gòu)形成的微生態(tài)系統(tǒng)。當(dāng)這個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性遭到破壞時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致腸道中潛在性病原體(包括條件致病菌)的定植和入侵。腸道常駐菌群通過競(jìng)爭(zhēng)腸黏膜上的黏附、分泌抗菌物質(zhì)、增加黏液分泌來(lái)抑制致病菌的定植和生長(zhǎng)［22］;也可分泌乳酸和短鏈脂肪酸(如乙酸、丙酸和丁酸等)來(lái)降低腸道pH與氧化還原電勢(shì);其中，丁酸作為上皮細(xì)胞的主要能量物質(zhì)會(huì)影響腸上皮細(xì)胞的增殖和分化，有助于加強(qiáng)腸道緊密連接［23］。

1.4 腸道免疫屏障

腸道作為動(dòng)物體中最大的免疫器官承擔(dān)著耐受飼糧抗原和免疫防御的雙重任務(wù)。腸道的免疫防御系統(tǒng)主要由腸道相關(guān)淋巴組織(gut-associated lymphatic tissue，GALT)構(gòu)成，是機(jī)體最大的淋巴器官和重要的黏膜相關(guān)淋巴組織，是飼養(yǎng)過程中防御病原體侵入機(jī)體的第一道防線。雞GALT主要由分布于腸道黏膜固有層和黏膜下層的淋巴細(xì)胞組成［24］。雞發(fā)達(dá)的 GALT彌補(bǔ)了其缺乏淋巴結(jié)的不足。而腸道免疫應(yīng)答系統(tǒng)中的主要效應(yīng)因子是由漿母細(xì)胞分泌的分泌型免疫球蛋白A(secretory IgA，sIgA)，它可以強(qiáng)有力地與抗原相結(jié)合，阻止病毒、細(xì)菌等有害抗原在腸上皮上的黏附并繼而促發(fā)腸道的體液和細(xì)胞免疫，最終有效免疫排斥或清除有害抗原。

2 家禽腸道屏障功能的評(píng)價(jià)

目前評(píng)估動(dòng)物腸道屏障功能的方法眾多，歸結(jié)起來(lái)主要包括測(cè)定腸道通透性、血漿內(nèi)毒素、細(xì)菌移位、腸道黏膜組織學(xué)觀察等方法。

2.1 腸道通透性

腸道通透性作為腸壁的正常功能，既允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過腸壁，又起到阻止?jié)撛诘挠泻ξ镔|(zhì)透過腸壁進(jìn)入機(jī)體的屏障作用［25］。腸道通透性的異常說(shuō)明腸黏膜可能受到了一定程度的損傷和破壞。因此腸道通透性已被認(rèn)為是反映腸道屏障功能最主要的指標(biāo)［25］而廣泛應(yīng)用于人體和動(dòng)物的研究中。

目前常用于腸道通透性的測(cè)定方法有分子探針法、血漿二胺氧化酶(diamine oxidase)活性法和體外尤斯灌流室(ussing chamber)法等。目前在人體臨床和動(dòng)物研究中通常運(yùn)用無(wú)毒副作用的非代謝性糖類(如乳果糖、三氯蔗糖、鼠李糖、甘露醇等)［26-27］和同位素類［如51鉻 -乙二胺四乙酸(51Cr-EDTA)］［28］等分子探針來(lái)評(píng)估腸道通透性。但此方法通常需通過檢測(cè)尿中的分子探針含量，而家禽糞尿無(wú)法分離因而此法不適用于家禽研究中。此外，熒光標(biāo)記的分子探針(如異硫氰酸熒光素 -葡聚糖)［29］和辣根過氧化物酶［30］等方法通過注入到動(dòng)物特定腸段后測(cè)定血液中的標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)該腸段的通透性，但在家禽研究中鮮少見運(yùn)用。二胺氧化酶是存在于所有哺乳動(dòng)物腸黏膜上皮絨毛中的高活性細(xì)胞內(nèi)酶。當(dāng)腸黏膜遭受損傷時(shí)釋放出大量二胺氧化酶，導(dǎo)致血液和腸腔中的二胺氧化酶活性增高而腸黏膜中二胺氧化酶活性降低。因此，檢測(cè)血液和腸黏膜二胺氧化酶活性的變化可以反映腸道屏障功能。但是，家禽腸黏膜中二胺氧化酶活性低，因而此法也不能用來(lái)評(píng)測(cè)家禽腸道屏障功能。尤斯灌流室系統(tǒng)于1951年被介紹于世，其原理是利用微電極檢測(cè)細(xì)胞膜離子通道電流信號(hào)的變化來(lái)反映腸道的通透性、分泌以及對(duì)藥物吸收的變化。目前該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物上皮組織的研究，既可以應(yīng)用于研究腸道上皮的通透性、內(nèi)毒素和細(xì)菌移位的途徑及機(jī)制，也可用于研究各種添加劑保護(hù)腸道屏障功能的機(jī)制。運(yùn)用尤斯灌流室系統(tǒng)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞跨膜電阻抗和同位素或熒光素標(biāo)記的大分子物質(zhì)通過胃腸道上皮的比例已成為評(píng)估腸道通透性的金標(biāo)準(zhǔn)。目前，這一技術(shù)在家禽營(yíng)養(yǎng)吸收和腸道屏障功能研究上的應(yīng)用已越來(lái)越多。

2.2 腸道細(xì)菌移位和血漿內(nèi)毒素

結(jié)構(gòu)和功能完整的腸道對(duì)細(xì)菌構(gòu)成屏障作用，細(xì)菌難以進(jìn)入血液循環(huán)。當(dāng)腸道屏障受損導(dǎo)致腸黏膜通透性增加時(shí)，細(xì)菌就可通過腸黏膜進(jìn)入體循環(huán)以及肝臟、脾臟、肺臟等器官，此過程叫細(xì)菌移位，可觸發(fā)全身炎性反應(yīng)甚至多器官功能的衰竭［31］。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌在代謝過程中或死亡后從細(xì)胞壁中釋放出來(lái)的類脂多糖體(脂多糖)。內(nèi)毒素因隨腸道細(xì)菌的移位進(jìn)入血液循環(huán)，并引起機(jī)體一系列生理病理改變［32］。因此，檢測(cè)腸道細(xì)菌移位和血漿內(nèi)毒素可間接反映腸黏膜整體的屏障功能［33］。檢測(cè)細(xì)菌移位常用的方法包括標(biāo)記細(xì)菌示蹤法、細(xì)菌培養(yǎng)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)等。

2.3 腸道黏膜組織形態(tài)

腸黏膜組織學(xué)觀察是運(yùn)用光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡等工具來(lái)評(píng)估腸道屏障功能的最常用和最直接的方法，可直接觀察腸道上皮細(xì)胞形態(tài)、絨毛結(jié)構(gòu)、排列及上皮細(xì)胞連接復(fù)合體的狀況。這些腸黏膜指標(biāo)的變化可在一定程度上反映腸道機(jī)械屏障的損傷，適用于各種動(dòng)物的試驗(yàn)研究。

3 腸道屏障功能的發(fā)育

家禽胚胎期小腸的發(fā)育速度隨著孵化時(shí)間的推進(jìn)而增加，其腸道形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方面的變化主要在出殼后1～14 d［34］，那么家禽腸道屏障功能從胚胎期至出殼后也可能存在一定的發(fā)育過程和規(guī)律。早期的研究發(fā)現(xiàn)，雞蛋孵化4 d后，occludin蛋白在胃腸道中出現(xiàn)微弱的表達(dá)，隨后逐漸增強(qiáng)。至孵化第11天，僅在腸上皮細(xì)胞的頂端(如連接復(fù)合體內(nèi))可發(fā)現(xiàn)很強(qiáng)的occludin蛋白分布，而上皮細(xì)胞的其他區(qū)域只能顯示其微弱的表達(dá)［14］。

對(duì)于claudin蛋白的研究，在雞胚胎期5～8 d時(shí)就在腸上皮上發(fā)現(xiàn)有claudin-1和claudin-3的表達(dá)［15，35-36］。近年來(lái)，對(duì)從胚胎期至出殼后早期claudin-3、-5、-16蛋白在雞腸上皮發(fā)育模式的研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)在雞出殼階段要么改變了其在細(xì)胞內(nèi)的分布要么第1次被檢測(cè)到［13］。出殼后，claudin-3主要分布在整根腸絨毛的基底側(cè)區(qū)域，隱窩部不見其分布;claudin-5主要分布在隱窩和絨毛底部的連接復(fù)合體內(nèi)，而claudin-16分布于絨毛上部的杯狀細(xì)胞內(nèi);claudin-3、-5、-16 mRNA的表達(dá)水平均在孵化18～20 d升高，出殼2 d后下降，這些claudin蛋白在出殼前后呈現(xiàn)它們穩(wěn)定的分布，暗示這些蛋白質(zhì)除了它們?cè)诰o密連接中的屏障功能外，可能在雞腸道的分化和生理機(jī)能方面也扮演著重要角色，如claudin-16分布在相對(duì)較成熟的絨毛上部的杯狀細(xì)胞內(nèi)提示其對(duì)杯狀細(xì)胞的成熟和黏液的分泌可能起到重要作用;而ZO-2在胚胎期18 d時(shí)其基因mRNA表達(dá)水平最高，然后開始下降，直至出殼后2 d降至穩(wěn)定值。ZO-2表達(dá)規(guī)律與claudin存在很大的不同，ZO-2先于claudin-3和-5蛋白的轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄水平在claudin轉(zhuǎn)錄增加前2天就達(dá)到高水平［13］。這可能是由于ZO-2是負(fù)責(zé)連接緊密連接和細(xì)胞骨架的銜接蛋白［10］，并啟動(dòng) claudins的分布和接緊密連接結(jié)構(gòu)的形成［37］。

不同腸段的屏障功能均需在出殼后持續(xù)發(fā)育一段時(shí)間，且不同腸段的屏障功能及其緊密連接蛋白的發(fā)育速度并不一致［38］?？漳c的跨上皮電阻在雞出殼后2 d開始增加，到出殼后11 d達(dá)到平臺(tái)值，而回腸的跨上皮電阻在雞出殼后2 d開始線性增加，到出殼后14 d時(shí)還未達(dá)到平臺(tái)值;空腸的occludin mRNA表達(dá)隨著日齡而線性增加，到出殼后14 d時(shí)還未達(dá)到平臺(tái)值，但回腸occludin和ZO-2 mRNA表達(dá)并未受出殼后日齡增長(zhǎng)的影響［38］。

4 家禽腸道屏障的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控

4.1 微量元素鋅(Zn)

Zn已被證實(shí)在維護(hù)動(dòng)物胃腸道上皮屏障的完整及其功能上起到非常重要的作用。在飼糧中添加Zn可降低疾病、營(yíng)養(yǎng)不良、應(yīng)激和腸道病菌感染等狀態(tài)下人體和動(dòng)物的腸道通透性［39-42］。而Zn的缺乏可導(dǎo)致Caco-2細(xì)胞跨上皮電阻降低和緊密連接及黏著連接的發(fā)生改變［43］。對(duì)家禽的研究顯示，飼糧中添加Zn元素(以硫酸鋅形式)可以顯著增加感染鼠傷寒沙門氏菌肉仔雞回腸的絨毛高度與隱窩比、occludin和claudin-1 mRNA的表達(dá)，顯著降低血漿內(nèi)毒素水平，從而減緩沙門氏菌感染造成的腸道屏障功能的損傷［44］。而Hu等［45］卻認(rèn)為，氧化鋅和蒙脫石均沒有改善腸道形態(tài)、微生物數(shù)量和屏障功能的作用。與對(duì)照、蒙脫石、氧化鋅和硫酸鋅相比，以氧化鋅蒙脫石復(fù)合物的形式添加60 mg/kg Zn可顯著降低雞腸道中梭菌數(shù)量，顯著提高直腸跨上皮電阻抗值，顯著降低直腸對(duì)甘露醇的通透性及回腸和直腸對(duì)菊粉的通透性［45］。

4.2 益生菌和益生元

大量的人體和動(dòng)物試驗(yàn)已證實(shí)益生菌和益生元可起到保護(hù)和改善腸道屏障功能的作用。近幾年，益生菌和益生元對(duì)家禽腸道屏障功能影響的研究也開始增多。在肉仔雞飼糧中添加鮑氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis B10)可顯著增加 occludin、claudin-2、claudin-3的mRNA表達(dá)，并顯著增加了小腸絨毛高度、寬度、杯狀細(xì)胞數(shù)量、空腸IgA陽(yáng)性細(xì)胞，顯著改善了腸道的白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)、白細(xì)胞介素 -10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和 sIgA含量，從而來(lái)綜合改善腸道的屏障功能［18］。由唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)和羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)組成的混合益生菌制劑顯著增加了十二指腸絨毛/隱窩深度值、顯著降低了回腸隱窩深度，從而改善了腸絨毛組織形態(tài);通過尤斯灌流室技術(shù)測(cè)定了腸黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖能力和組織導(dǎo)電性，認(rèn)為混合益生菌制劑可增加空腸和大腸對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)腸組織導(dǎo)電性無(wú)影響，說(shuō)明混合益生菌制劑在維持腸上皮屏障結(jié)構(gòu)的同時(shí)提高了其功能［46］。乳 酸 桿 菌 (Lactobacillus fermentum 1.2029)處理可降低感染壞死性腸炎肉仔雞的腸道損傷程度，改善回腸上皮微絨毛，增加claudin-1和occludin的mRNA表達(dá)，顯示其具有保護(hù)腸道屏障功能的作用［47］。

熱應(yīng)激在家禽生產(chǎn)業(yè)中經(jīng)常發(fā)生，對(duì)動(dòng)物健康、生產(chǎn)性能以及腸黏膜結(jié)構(gòu)和微生物菌群都存在很大的負(fù)面影響［48-49］。在對(duì)腸道屏障功能的影響方面，熱應(yīng)激可引發(fā)肉仔雞十二指腸、空腸和回腸輕微的多灶性淋巴漿細(xì)胞性腸炎，并使感染腸炎沙門氏菌肉仔雞的腸道屏障遭到破壞，導(dǎo)致沙門菌通過腸黏膜遷移到脾臟和小腸壁炎性浸潤(rùn)加重，使3個(gè)腸段發(fā)展成中度多灶性淋巴漿細(xì)胞性腸炎［50］。熱應(yīng)激還可使肉雞腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量減少，大腸桿菌和梭菌數(shù)量增加，空腸絨毛高度降低，隱窩深度增加，空腸絨毛高度/隱窩深度值降低，空腸跨上皮電阻降低，異硫氰酸熒光素葡聚糖的細(xì)胞旁通透性增加，occludin和ZO-1的蛋白表達(dá)下調(diào)［51］。而飼糧中添加地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的混合益生菌制劑可使無(wú)論是正常溫度下還是熱應(yīng)激狀態(tài)下飼養(yǎng)的肉雞的腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量、空腸絨毛高度和occludin蛋白表達(dá)增加，大腸桿菌數(shù)量降低，從而來(lái)改善腸道屏障功能［51］。添加纖維寡糖可通過增加肉雞空腸絨毛高度和空腸絨毛高度/隱窩深度值，降低異硫氰酸熒光素葡聚糖的細(xì)胞旁通透性，從而減輕熱應(yīng)激給肉仔雞腸道屏障造成的負(fù)面影響［52］。

4.3 多糖

β-1，3/1，6-葡聚糖是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的葡萄糖多聚復(fù)合物，可增強(qiáng)宿主先天性免疫和獲得性免疫功能，增強(qiáng)抗病原細(xì)菌、病毒和寄生蟲感染的能力。通過在飼糧中添加β-1，3/1，6-葡聚糖增加了感染鼠傷寒沙門氏菌肉仔雞的空腸絨毛高度、空腸絨毛高度/隱窩深度值、杯狀細(xì)胞數(shù)量、sI-gA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和sIgA含量，降低了盲腸沙門氏菌數(shù)量和肝臟中沙門氏菌的數(shù)量，上調(diào)了claudin-1和occludin的mRNA表達(dá)，從而減緩由感染鼠傷寒沙門氏菌引起的肉仔雞腸道屏障功能的損失［53］。車前草非淀粉多糖已在體外和離體試驗(yàn)中被證實(shí)其可阻止多種病原菌黏附和侵襲人上皮細(xì)胞。在肉雞飼糧中添加車前草非淀粉多糖50 mg/d可減少沙門氏菌對(duì)肉仔雞脾臟的侵襲;體外試驗(yàn)的結(jié)果顯示，車前草非淀粉多糖可抑制沙門氏菌對(duì)豬腸上皮細(xì)胞和雞盲腸隱窩上皮的黏附，經(jīng)回腸黏膜尤斯灌流室離體試驗(yàn)證實(shí)這種作用與增加的黏膜短路電流而跨上皮電阻不變相關(guān)。車前草非淀粉多糖的這種抑制活性主要是其酸性的果膠分成在起作用［54］。

4.4 谷氨酰胺

谷氨酰胺(glutamine，Gln)是腸上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源，對(duì)腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化是必需的。已有研究報(bào)道Gln在人危急病癥和嚙齒動(dòng)物的各種腸炎模型中起到維持、促進(jìn)和保護(hù)腸道的屏障功能。在Caco-2腸細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)液缺乏Gln或抑制Gln合酶會(huì)降低跨上皮電阻抗值，增加甘露醇的滲透性，而減少緊密連接蛋白(ZO-1、occludin和claudin-1)表達(dá)及擾亂occludin和claudin-1分布會(huì)引起屏障功能的損傷［55］。這說(shuō)明Caco-2腸細(xì)胞中緊密連接蛋的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)的分布依賴于Gln。Gln缺乏導(dǎo)致的跨上皮電阻抗值降低通過PI3K抑制或敲除恢復(fù)，說(shuō)明Gln是通過PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)緊密連接的完整性和緊密連接蛋白［56］。Gln可阻止由乙醛(乙醇的氧化代謝產(chǎn)物)誘發(fā)的Caco-2細(xì)胞單層旁通路通透性增加和緊密連接的破壞，并認(rèn)為Gln的這個(gè)作用涉及到表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)受體依賴機(jī)制［57］。最近的研究認(rèn)為，通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路調(diào)控occludin和claudin-1可阻止甲氨蝶呤誘導(dǎo)的腸道屏障的破壞［58］。關(guān)于Gln對(duì)家禽腸道屏障影響的研究尚未見報(bào)道，值得關(guān)注和探討。

4.5 蘇氨酸

蘇氨酸是豬或家禽的第二或第三限制性氨基酸。研究證實(shí)，蘇氨酸在維持動(dòng)物腸道形態(tài)、黏液分泌、刷狀緣酶活性和生長(zhǎng)性能中重要作用。在家禽的研究中，添加蘇氨酸可顯著提高肉仔雞唾液酸的分泌，顯著提高肉鴨的腸道黏液分泌量和黏蛋白MUC2 mRNA表達(dá)，對(duì)肉雞杯狀細(xì)胞密度和MUC2 mRNA表達(dá)無(wú)影響［59］。蘇氨酸的缺乏可顯著降低雞十二指腸和回腸的黏液層厚度，添加蘇氨酸可顯著增加黏液的分泌且不依賴MUC2的基因表達(dá)［60］。然而，有研究認(rèn)為蘇氨酸添加對(duì)蛋雞杯狀細(xì)胞數(shù)量、絨毛高度和黏膜厚度等腸道形態(tài)指標(biāo)無(wú)影響［61］。在腸道屏障研究中，中等程度的蘇氨酸缺乏(每千克飼糧6.5 g蘇氨酸)會(huì)顯著增加仔豬回腸黏膜旁細(xì)胞通透性，改變調(diào)控旁細(xì)胞通透性的相關(guān)基因的表達(dá)，如緊密連接蛋白ZO-1、扣帶蛋白、MLCK等;而每千克飼糧添加0.93 g蘇氨酸可顯著增加仔豬回腸旁細(xì)胞通路通透性和MUC1、ZO-1的基因表達(dá)［62］。關(guān)于蘇氨酸對(duì)家禽腸道屏障影響的研究仍尚未見報(bào)道。

4.6 脫毒劑

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是谷物中最為常見的一種真菌。給肉仔雞飼喂DON會(huì)影響肉仔雞十二指腸和空腸腸壁形態(tài)，顯著上調(diào)空腸claudin-5的mRNA表達(dá)，但對(duì)claudin-1、ZO-1和ZO-2的mRNA表達(dá)無(wú)影響。飼糧中添加黏土類霉菌毒素吸附劑使回腸claudin-1、claudin-5、ZO-1和ZO-2的mRNA表達(dá)均上調(diào)了。飼喂DON的肉仔雞在空腸檢測(cè)到高濃度Toll樣受體4和氧化應(yīng)激的2個(gè)標(biāo)記物亞鐵血紅素和黃嘌呤氧化還原酶，而在回腸濃度較低，但添加黏土類霉菌毒素吸附劑后卻在回腸中濃度較高。這些結(jié)果說(shuō)明黏土類霉菌毒素吸附劑導(dǎo)致DON在小腸較遠(yuǎn)端聚集，可影響腸道形態(tài)和屏障功能［16］。

4.7 EGF

EGF是一種小肽，對(duì)腸上皮具有很廣泛的生物學(xué)作用。飼養(yǎng)試驗(yàn)顯示，EGF可減少肉雞空腸彎曲桿菌在空腸的定植及移位到肝臟和脾臟的數(shù)量;體外研究表明，空腸彎曲桿菌可黏附并入侵到犬腸上皮細(xì)胞中，破壞緊密連接蛋白claudin-4，增加腸上皮通透性和非致病的非侵入性菌大腸桿菌C25的移位;而用EGF對(duì)犬腸上皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可消除空腸彎曲桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的負(fù)作用，并認(rèn)為EGF改善腸道屏障功能的作用依賴于上皮細(xì)胞上EGF受體的激活［63］。

4.8 飼用酶制劑

在小麥-豆粕基礎(chǔ)飼糧中添加木聚糖酶可通過減輕產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的肉雞腸道組織損傷，增加回腸和空腸絨毛和隱窩比值，優(yōu)化回腸腸道菌群組成，增加回腸occludin mRNA和MUC2 mRNA表達(dá)，降低回腸細(xì)胞凋亡率等來(lái)緩解氣莢膜梭菌感染對(duì)腸道屏障功能造成的損傷，使血漿內(nèi)毒素降低［64］。

溶菌酶作為一種存在于機(jī)體正常體液及組織中的非特異性免疫因子，能有效地水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的損傷。本課題組通過外源添加溶菌酶減輕了產(chǎn)氣莢膜梭菌感染對(duì)肉仔雞腸道造成的損傷，減少了產(chǎn)氣莢膜梭菌在回腸的定植，抑制了回腸大腸桿菌和乳酸桿菌的過度增長(zhǎng)，從而改善了產(chǎn)氣莢膜梭菌感染肉仔雞的腸道屏障功能，使脾臟細(xì)菌移位率降低［65］。

5 小結(jié)與展望

目前，關(guān)于家禽腸道屏障各方面的研究還相當(dāng)少，尤其是對(duì)組成家禽腸道屏障的蛋白質(zhì)的分布和功能、影響腸道通透性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等理論基礎(chǔ)方面均有待大力研究。研究中檢測(cè)腸道通透性的方法較多，對(duì)各種方法的靈敏性和特異性及在不同動(dòng)物和細(xì)胞模型中適用性的研究較少，多種方法的聯(lián)合使用是否可提高靈敏性和特異性從而來(lái)正確有效地監(jiān)測(cè)仍值得探討。此外，通過營(yíng)養(yǎng)措施來(lái)調(diào)控腸道屏障功能的研究還主要集中于人類醫(yī)學(xué)和哺乳動(dòng)物上，在家禽上的應(yīng)用技術(shù)及其調(diào)控機(jī)制研究還很有限，尚待全面、深入、持續(xù)地進(jìn)行探索。

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