飼料中玉米赤霉烯酮的生物降解

計(jì) 成

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

霉菌毒素(mycotoxin)是由曲霉菌屬(Aspergillus spp.)、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)和青霉菌屬(Penicillium spp.)等真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物［1］。目前已經(jīng)報(bào)道，大約有300多種霉菌代謝產(chǎn)物對(duì)人類和動(dòng)物具有毒害作用，其中，黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)、單端孢霉烯族毒素［trichothecenes，如 T-2毒素和嘔吐毒素(DON)］、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)、赭曲霉毒素(ochratoxin A，OTA)及伏馬毒素(fumonisins)等是對(duì)畜牧業(yè)威脅最大的幾種霉菌毒素［2］。ZEA，又稱F-2毒素，是一種非類固醇類的、具有類雌激素作用的真菌毒素，主要由禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌、粉紅鐮刀菌和雪腐鐮刀菌等多種鐮刀菌產(chǎn)生［3］。ZEA的化學(xué)名為6-(10-羥基 -6-氧基-十一碳烯基)-β-雷鎖酸內(nèi)酯，分子式是C18H22O5，相對(duì)分子質(zhì)量為318。ZEA紫外線光譜的最大吸收波長(zhǎng)有236、274和316 nm，紅外線光譜的最大吸收波長(zhǎng)為970 nm。ZEA的熔點(diǎn)為161～163℃，ZEA不溶于水、二氧化碳(CO2)和四氯甲烷(CCl4)，溶于堿性水溶液和甲醇、乙腈、乙醚、苯、二氯甲烷、乙醇和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，微溶于石油醚。

1 ZEA污染現(xiàn)狀

據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，每年全世界有25%的谷物受各種各樣的霉菌毒素污染，其中2%的糧食由于霉菌毒素污染而不能食用，僅畜禽食用霉菌毒素污染的飼料使美國(guó)畜牧業(yè)每年遭受近10億美元的經(jīng)濟(jì)損失，而對(duì)全世界造成的經(jīng)濟(jì)損失，每年達(dá)數(shù)千億美元，而且這種趨勢(shì)有增無(wú)減［4］。而鐮刀菌毒素是造成全世界谷物經(jīng)濟(jì)損失最大的一類污染性霉菌毒素。鐮刀菌產(chǎn)生毒素的過(guò)程主要發(fā)生于谷物收獲之前，但若在收倉(cāng)存放前沒(méi)有經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)母稍锏确椒ㄌ幚恚牭毒矔?huì)在谷物存放階段大量產(chǎn)生毒素。ZEA廣泛存在于霉變的玉米、小麥、大麥、燕麥、高粱等谷物以及奶產(chǎn)品中，是世界上污染范圍最廣的一種鐮刀菌毒素。Elisabeth等［5］測(cè)定了2004—2011年世界范圍內(nèi)共計(jì)13 578個(gè)飼料及飼料原料樣品中ZEA含量，結(jié)果表明，樣品中ZEA檢出率為36%，平均含量為101μg/kg，最高含量高達(dá)26 728μg/kg。王金勇等［6］對(duì)2012年從我國(guó)采集的841個(gè)飼料原料和飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，我國(guó)的飼料原料和飼料均受到不同程度的ZEA污染，其中，豬料、禽料、玉米和干酒糟及其可溶物(DDGS)的呈陽(yáng)性的ZEA平均含量分別為446、977、658 和 659 μg/kg。雷元培等［7］2011年對(duì)北京地區(qū)131個(gè)飼料原料和飼料樣品抽樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，玉米、麩皮、DDGS和豬全價(jià)飼料中ZEA陽(yáng)性檢出率均達(dá)100.00%，豆粕中ZEA陽(yáng)性檢出率達(dá)54.45%。其中，DDGS污染情況最嚴(yán)重，ZEA最高含量達(dá)5 957.87μg/kg，平均含量達(dá)(882.68 ±146.40)μg/kg。由此可見(jiàn)，我國(guó)的ZEA污染情況嚴(yán)重。

2 動(dòng)物ZEA中毒癥

豬是對(duì)ZEA最敏感的動(dòng)物，特別是青春期前的母豬，其對(duì)ZEA的敏感性更強(qiáng)。ZEA中毒可引起豬性早熟、母豬發(fā)情周期延長(zhǎng)、假發(fā)情、卵巢萎縮、持久黃體、母豬假孕和流產(chǎn)、窩產(chǎn)仔數(shù)減少或產(chǎn)弱仔等癥狀［8-9］。Price等［10］報(bào)道，高劑量的ZEA(50～100 mg/kg)可對(duì)母豬排卵、受孕、胚胎定植、胎兒發(fā)育和新生兒的生活力造成顯著的影響，并且會(huì)出現(xiàn)明顯的外陰陰道炎、陰道和直腸垂脫，同時(shí)，母豬ZEA中毒出現(xiàn)連續(xù)動(dòng)情會(huì)導(dǎo)致不育、假孕、卵巢畸形和流產(chǎn)等一系列的生殖障礙［11-12］。母豬或仔豬接觸ZEA時(shí)的階段不同、接觸ZEA的持續(xù)時(shí)間和劑量不同，都將會(huì)導(dǎo)致母豬或仔豬出現(xiàn)不同程度的雌激素中毒癥狀(如輕微中毒時(shí)出現(xiàn)陰戶和乳頭紅腫、子宮和陰道腫大，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)出現(xiàn)陰道或直腸脫垂)［13-15］。Collins等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在懷孕母鼠第6～19天的飼糧中添加8 mg/kg的ZEA可引起胎兒發(fā)育延遲、骨骼肌發(fā)育遲鈍以及初生小鼠的成活率降低。同時(shí)，大量研究證明，ZEA和 α-玉米赤霉烯醇(αzearalenol，α-ZOL)對(duì)雄性動(dòng)物的生殖發(fā)育也具有一定的負(fù)面影響。在雄性動(dòng)物體內(nèi)，ZEA和α-ZOL能夠通過(guò)影響雄性動(dòng)物睪酮的分泌，進(jìn)而影響成年雄性動(dòng)物精子的發(fā)生、成熟和性功能［17］。Young等［18］報(bào)道，公豬采食 ZEA含量為9 mg/kg的飼糧，公豬的精液質(zhì)量明顯下降(如精液的總量、總活精數(shù)以及凝膠自由體積)。Wilson等［19］報(bào)道，放牧公山羊耳埋36 mg ZEA 90 d后，其攻擊性行為、睪丸生長(zhǎng)和性欲活動(dòng)都明顯減少。同時(shí)，體外研究表明，于精液中添加ZEA和α-ZOL，精子生存力和生活力會(huì)顯著降低，公豬精子的生育能力下降［20-21］。圖1為ZEA引起的母豬外陰紅腫和脫落癥狀，圖2為ZEA中毒引起的子宮腫大癥狀。

圖1 ZEA引起的外陰紅腫、陰道和直腸脫垂Fig.1 Swell of the vulva and prolapse of the vagina and rectum caused by ZEA

圖2 ZEA對(duì)母豬子宮的影響Fig.2 Effects of ZEA on uterus of sows

3 ZEA毒理作用機(jī)制

ZEA和其代謝產(chǎn)物都具有雌激素活性作用，主要是因?yàn)樗鼈兡軌蚺c胞膜上的雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合，使 ER發(fā)生構(gòu)型改變，ZEA與ER形成的復(fù)合物被轉(zhuǎn)移至核內(nèi)將會(huì)和雌激素效應(yīng)元件結(jié)合，從而對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成進(jìn)行調(diào)節(jié)［22］。Kuiper-Goodman 等［9］研究結(jié)果表明，在ZEA和其最主要的幾種代謝產(chǎn)物之中，α-ZOL與ER的結(jié)合力最高，ZEA及其代謝產(chǎn)物與ER的相對(duì)結(jié)合力高低順序依次是α-ZOL＞α-玉米赤霉醇(α-ZAL)＞β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)＞ZEA＞β-玉米赤霉醇(β-ZAL)。ER有1個(gè)具有反式激活功能的高度變異的N末端區(qū)，1個(gè)負(fù)責(zé)特定的DNA結(jié)合、二聚化及核定位的高度保守的中央?yún)^(qū)，以及1個(gè)參與配體結(jié)合及配體依賴的反式激活功能的C末端區(qū)［23］。ER與雌激素分子之間的親和力非常高，能夠通過(guò)受體特異性進(jìn)行結(jié)合。Dees等［24］研究發(fā)現(xiàn)，ZEA在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)與ER結(jié)合后，被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，進(jìn)而與細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)相結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，從而對(duì)細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，加速乳腺癌細(xì)胞MCF-7進(jìn)入細(xì)胞周期，促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖。

ZEA可導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)DNA和染色體的損傷，這可能是ZEA引起動(dòng)物機(jī)體出現(xiàn)一系列中毒癥狀的原因之一。據(jù) Abid-Essefi等［25］報(bào)道，ZEA 在1～15μg/mL細(xì)胞懸液濃度范圍內(nèi)可導(dǎo)致細(xì)胞DNA發(fā)生損傷，且具有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。Ouanes等［26］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng) ZEA 的劑量為 2～20 mg/kg時(shí)，可誘導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)染色體出現(xiàn)不同程度和不同類型的變異、畸形，該劑量達(dá)到半數(shù)致死量的0.4% ～4.0%。但相同劑量ZEA分次連續(xù)注射和一次性注射導(dǎo)致的染色體損傷程度不同，分次連續(xù)注射對(duì)染色體的損傷比一次性注射更加嚴(yán)重。

4 ZEA生物降解國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

ZEA污染范圍廣泛，危害程度嚴(yán)重，因此，有效控制和解決其對(duì)糧食和飼料的污染，對(duì)改善動(dòng)物生產(chǎn)性能和提高人類食品安全有著非常重要的意義。目前去除飼料中ZEA的方法主要包括物理法、化學(xué)法和生物降解法。傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法雖然能部分地去除飼料和飼料原料中的霉菌毒素，但這些方法都有著效果不穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)成分損失大、影響飼料適口性和難以規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用等不可避免的缺點(diǎn)，而且在飼料和飼料原料中添加化學(xué)試劑也會(huì)將一些不確定的危害因素引入動(dòng)物生產(chǎn)環(huán)節(jié)中［27-28］。近年來(lái)ZEA生物降解方法越來(lái)越受到重視。ZEA的生物降解方法主要是指微生物、植物或其代謝時(shí)產(chǎn)生的酶與ZEA發(fā)生作用并使ZEA分子結(jié)構(gòu)中毒性基團(tuán)被破壞從而生成無(wú)毒代謝產(chǎn)物的過(guò)程［29］。由于微生物及其生物酶降解ZEA的方法能夠徹底去除毒素，同時(shí)，該方法的專一性強(qiáng)、對(duì)飼料無(wú)污染、不會(huì)影響飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此，該方法在動(dòng)物霉變飼料和飼料原料中的應(yīng)用具有廣闊的發(fā)展前景。

4.1 降解ZEA的真菌

研究報(bào)道黏帚霉(Gliocladium sp.)屬中的粉紅黏帚霉(Gliocladium roseum)可通過(guò)一系列脫羧反應(yīng)使大部分ZEA開(kāi)環(huán)生成無(wú)毒化合物［30-32］。Varga等［33］報(bào)道，根霉菌屬(Rhizopus sp.)中的米根霉(Rhizopus oryzae)、葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)和小孢根霉(Rhizopus microsporus)能將ZEA完全降解。雅致枝霉(Thamnidium elegans)和貝勒被毛霉(Mucor bainieri)使ZEA成ZEA-4-O-β-葡糖苷［34］，龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)和班尼小克銀漢霉(Cunninghamella bainieri)將ZEA分別轉(zhuǎn)化成8’-羥基-ZEA和2，4-二甲氧基-ZEA［35］。研究報(bào)道，少根根霉(Rhizopus arrhizus)［36］和 黑 曲 霉 (Aspergillus section Nigri)［37］能將ZEA上C-4位的羥基氧化為硫酸根，從而將ZEA轉(zhuǎn)化為低毒的硫酸-ZEA。Molnar等［38］報(bào)道解毒毛孢酵母(Trichosporon mycotoxinivorans)可在24 h內(nèi)將ZEA降解成二氧化碳或者無(wú)熒光和無(wú)紫外吸收的代謝物，其代謝物中沒(méi)有檢測(cè)到 α-ZOL、β-ZOL或ZEA的存在，并且認(rèn)為該菌可用于去除動(dòng)物飼糧中的霉菌毒素。Vekiru等［39］使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、液相色譜二極管陣列(DAD)以及核磁共振(NMR)方法對(duì)解毒毛孢酵母生物降解ZEA的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZEA分子中的大環(huán)被打開(kāi)，代謝生成了非雌激素化合物。

4.2 降解ZEA的細(xì)菌

目前，關(guān)于細(xì)菌降解ZEA的研究報(bào)道較少，黏質(zhì)塞氏桿菌(Serratia marcescens)［40］、假單胞菌(Pseudomonas sp.)［41-42］、動(dòng)球桿菌(Planococcus sp.)［43］、來(lái)源于土壤的細(xì)菌混合物、豬腸道微生物混合物［44］能夠?qū)?ZEA進(jìn)行生物降解。同時(shí)，Yi等［45］研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)與ZEA孵育36 h后能夠降解95.8%的ZEA，同時(shí)該菌株還具有木聚糖酶、纖維素酶及蛋白酶活性，其在動(dòng)物飼糧中具有一定的應(yīng)用前景。Tinyiro等［46-47］分離到2株具有降解ZEA作用的芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)168和納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)CICC 24640，30℃供氧條件下與20μg/L ZEA作用24 h后，能夠分別降解81%和100%的 ZEA。除此之外，Cho等［48］從土壤中篩選得到1株枯草芽孢桿菌，其液態(tài)發(fā)酵24 h后能夠降解99%的ZEA，固態(tài)發(fā)酵48 h后能夠降解95%的ZEA。

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)細(xì)菌生物降解ZEA及其降解機(jī)理進(jìn)行了研究，并取得很大進(jìn)展。首先，Lei等［49］從72個(gè)自然界樣品及1 088株實(shí)驗(yàn)室保藏菌株中，篩選出1株能夠高效降解ZEA的枯草芽孢桿菌ANSB01G，其在液體培養(yǎng)基中對(duì)ZEA的降解率為88.65%，并且該菌能夠降解自然霉變玉米、DDGS和豬全價(jià)配合飼料中 84.58%、66.34% 以及 83.04% 的 ZEA。該菌對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌具有很好的抑菌活性，同時(shí)在高溫、胃酸和膽鹽條件下具有較高的存活率和活性。該菌株已經(jīng)申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利得到保護(hù)(專利號(hào) ZL 201010620651.2)。其次，雷元培［50］通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌ANSB01G降解ZEA特性的研究，發(fā)現(xiàn)該菌降解ZEA的活性物質(zhì)為一種細(xì)菌所產(chǎn)的胞外酶。通過(guò)用硫酸銨沉淀，離子交換層析、疏水層析和分子篩層析方法從菌株ANSB01G發(fā)酵液中分離出降解ZEA的活性蛋白，該活性物質(zhì)大致相對(duì)分子質(zhì)量范圍為 20.1×103～44.3×103。本實(shí)驗(yàn)室還通過(guò)高效液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用(HPLCMS)測(cè)定ZEA降解產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，推測(cè)菌株ANSB01G降解ZEA的作用機(jī)制，即首先ZEA分子中酚羥基與谷氨酸的γ-羧基結(jié)合，然后分子結(jié)構(gòu)中內(nèi)酯環(huán)水解、脫羧、還原羰基，最后脫水，該解毒機(jī)制是一種新的ZEA代謝途徑［50］。

4.3 降解ZEA的酶及酶制劑

2002 年，Takahashi-Ando 等［51］從粉紅黏帚霉IFO7063中分離純化得到能夠生物降解ZEA的內(nèi)酯水解酶(lactonohydrolase)，該酶能夠?qū)EA轉(zhuǎn)化成為無(wú)毒的代謝物排出體外。同時(shí)對(duì)編碼降解ZEA的基因(zhd101)進(jìn)行了克隆，并將該基因成功轉(zhuǎn)入到大腸桿菌(Escherichia coli)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)進(jìn)行了表達(dá)，外源表達(dá)該片段基因的大腸桿菌在24 h內(nèi)可將培養(yǎng)基中的ZEA、α-ZOL和β-ZOL全部降解成無(wú)毒的代謝產(chǎn)物［52］。此外，Igawa等［53］將 zhd101 基因?qū)氲接衩字械玫睫D(zhuǎn)基因玉米，使用該轉(zhuǎn)基因玉米可以在48 h內(nèi)將溶液中90%的ZEA去除，每克轉(zhuǎn)基因玉米種子可以去除16.9μg的ZEA。

5 小結(jié)

自從1966年發(fā)現(xiàn)ZEA以來(lái)，世界各國(guó)的科研工作者對(duì)ZEA的研究從未間斷過(guò)，主要包括ZEA的合成、代謝、毒理、檢測(cè)、降解和防治措施等方面。在ZEA脫毒方面，由于傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法在應(yīng)用上存在弊端，生物降解ZEA備受關(guān)注，但目前ZEA生物降解技術(shù)研究尚存在一些不足之處，還需進(jìn)一步深入研究。目前雖然在降解ZEA的微生物篩選方面取得了一定的進(jìn)展，但大部分研究報(bào)道沒(méi)有探明其作用機(jī)制，不能確定ZEA濃度的降低是因?yàn)槲⑸锏奈锢硇晕阶饔眠€是生物酶的生物降解作用。由于微生物的吸附作用是可逆的，毒素分子并沒(méi)有消失，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，部分毒素會(huì)重新釋放，因此，并不是很理想的解毒方法;其次，被證明能生物降解ZEA的微生物菌株數(shù)量和種類相對(duì)較少，特別是能直接應(yīng)用于飼料中降解ZEA的益生菌的報(bào)道更少。因此，需要進(jìn)一步篩選高效降解ZEA的益生菌，并對(duì)其生物降解機(jī)理和代謝途徑進(jìn)行深入研究和探討。

篩選降解飼料ZEA的益生菌是飼料工業(yè)未來(lái)研究發(fā)展的一個(gè)方向。益生菌可以直接應(yīng)用于飼料中，降解飼料ZEA的同時(shí)還具有益生性，不但生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，而且可降低生產(chǎn)者和養(yǎng)殖者的成本，易于規(guī)?；茝V和應(yīng)用。另外，運(yùn)用生物化學(xué)、分子生物學(xué)及基因工程等手段，將ZEA降解酶基因轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主細(xì)胞中，大量表達(dá)和生產(chǎn)ZEA降解酶，開(kāi)發(fā)高純度、高活性的新型降解酶飼料添加劑，也是飼料工業(yè)研究發(fā)展的方向。

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