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    2種不同分子量玻璃酸鈉對兔骨關(guān)節(jié)炎的療效研究

    2014-09-19 10:21:38陳文革
    中國生化藥物雜志 2014年6期
    關(guān)鍵詞:蛋白聚糖大分子分子量

    陳文革

    (湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院 關(guān)節(jié)外科,湖北 恩施 445000)

    2種不同分子量玻璃酸鈉對兔骨關(guān)節(jié)炎的療效研究

    陳文革

    (湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院 關(guān)節(jié)外科,湖北 恩施 445000)

    目的 觀察2種不同分子量玻璃酸鈉對骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。方法 采用關(guān)節(jié)內(nèi)注射木瓜蛋白酶構(gòu)建兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型,采用病理學(xué)研究,評價不同分子量玻璃酸鈉對骨關(guān)節(jié)炎的治療效果。結(jié)果 2種不同分子量玻璃酸鈉對骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的病變均有不同程度的治療作用;在注入木瓜蛋白治療兔骨關(guān)節(jié)模型中,150萬Da以下小分子量玻璃酸鈉病理評分為(1.3±0.16),明顯優(yōu)于對照組的(0.10±0.03)、模型組的(2.8±0.17)、大分子組的(1.90±0.03)(P<0.05),因此可以證明小分子量玻璃酸鈉在治療骨關(guān)節(jié)炎方面有更好的療效。結(jié)論 玻璃酸鈉治療骨關(guān)節(jié)炎療效確切,小分子量的玻璃酸鈉(80~150萬Da)在促進軟骨組織修復(fù)、減少滑膜組織增生方面更顯優(yōu)勢。

    玻璃酸鈉;不同分子量;骨關(guān)節(jié)炎;療效

    骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)為一種因關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病,多發(fā)于50歲以上人群。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查,我國60歲以上的老人OA的患病率達50%[1]。目前為止,對OA尚無有效的組織修復(fù)治療手段,臨床治療仍以控制疼痛、減少殘疾、改善關(guān)節(jié)功能為主[2]。玻璃酸鈉是粘多糖的一種,為關(guān)節(jié)液、關(guān)節(jié)軟骨等的組成成分,能夠潤滑滑膜關(guān)節(jié)、保護軟骨并有效維持關(guān)節(jié)的生物力學(xué)特性。玻璃酸鈉用于早期OA患者時,能夠阻斷其病情發(fā)展,起到一定的治療作用[3]。因此,玻璃酸鈉被認(rèn)為是對關(guān)節(jié)炎進行治療的有效方法[4]。玻璃酸鈉由于基本多糖的單位數(shù)量不同,因此存在著不同的分子量及大小情況[5]。而分子量大小不同的玻璃酸鈉在OA治療中產(chǎn)生的療效也有所不同[6]。本研究旨在通過建立動物模型,對2種不同分子量大小構(gòu)成的玻璃酸鈉進行研究,探討其對OA的治療作用。

    1 材料與方法

    1.1 試驗動物 日本大耳白兔,雌雄不限,年齡均為24個月;體質(zhì)量18~23 kg,平均(21±0.7)kg,購自第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,許可證:SCXK(滬)2012-0009,適宜環(huán)境自然光照下飼養(yǎng)。

    1.2 藥品和試劑 玻璃酸鈉注射液為山東博士倫福瑞達制藥有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字為H10960136。大分子玻璃酸鈉注射液,分子量為150~250萬Da;小分子玻璃酸鈉注射液,分子量為80~150萬Da??笴1q抗體IgG檢測試劑盒(北京歐蒙生物技術(shù)有限公司)。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 實驗分組:實驗白兔適應(yīng)實驗室環(huán)境1 w,分籠飼養(yǎng),并可以自由活動。將白兔采用隨機數(shù)字表法分為4組,每組10只。分別為模型組、生理鹽水對照組、大分子給藥組和小分子給藥組。

    1.3.2 骨病變造模:分別給模型組、2給藥組白兔右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入1.6%的木瓜蛋白(生理鹽水溶解),3 d后第二次注射。7 d后,對2給藥組白兔給予相應(yīng)分子量的玻璃酸鈉注射液,2組給藥劑量均為0.3mL;模型組白兔給予0.3mL生理鹽水,每周1次,共計5周。末次注射7 d后行磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)檢查,隨后對白兔進行解剖,打開關(guān)節(jié)腔并大致觀察情況,用100mL生理鹽水做關(guān)節(jié)腔沖洗,留取100mL沖洗液;取右膝關(guān)節(jié)標(biāo)本進行組織學(xué)檢測。左膝標(biāo)本作為對照。

    1.4 觀察指標(biāo)

    1.4.1 兔膝關(guān)節(jié)解剖情況大體觀察:觀察滑膜增生情況、關(guān)節(jié)囊、滑液情況、軟骨表面情況[7]。評分標(biāo)準(zhǔn):0分:關(guān)節(jié)面及色澤均如常;1分:關(guān)節(jié)面粗糙,裂痕小且色澤灰暗;2分:關(guān)節(jié)面潰爛,軟骨缺損至表中層;3分:關(guān)節(jié)形成潰瘍面,缺損至軟骨深層;4分:軟骨剝脫,且其下骨質(zhì)暴露。

    1.4.2 MRI檢查:患者采用常規(guī)矢狀位垂直于股骨內(nèi)外髁后緣連線的切面進行掃描;冠狀位采用平行于股骨內(nèi)外髁后緣連線的切面進行掃描。

    1.4.3 病理學(xué)檢查

    ①HE染色,做滑膜及軟骨病理學(xué)觀察:取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)平臺、軟骨下骨和滑膜,用4%多聚甲醛溶液固定24 h,EDTA脫鈣、脫水、石蠟包埋、切片。觀察滑膜組織是否肥厚增生,血管是否侵入,有無炎性細(xì)胞浸潤及軟骨層完整性、軟骨細(xì)胞分布及數(shù)量、潮線及軟骨下骨變化。

    ②沙黃O染色:石蠟切片脫蠟至水,以1%沙黃O染液染色10min,蒸餾水沖洗,常規(guī)無水酒精脫水、二甲苯透明,封片。觀察軟骨層的完整性、軟骨基質(zhì)中蛋白聚糖的含量變化阿爾新藍(lán)染色:石蠟切片脫蠟至水,行阿爾新藍(lán)染色5 min,沖洗、脫水、透明、封片。進行Image Pro Plus 5.1圖像分析,測出染色光密度(OD值),顯示蛋白聚糖的相對含量。

    ③Van Gieson氏染色:1%酸性復(fù)紅水溶液10mL、1.22%苦味酸飽和水溶液90 mL分別配好備用,用時混合。石蠟切片脫蠟,VG染液染色,水沖洗,酒精分色,脫水,透明,樹膠封片;觀察軟骨層中膠原總量的情況。同時進行Image Pro Plus 5.1進行圖像分析,測出染色光密度(OD值),顯示骨膠原總量的相對含量。

    1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)采用抗C1q抗體IgG檢測試劑盒檢測關(guān)節(jié)沖洗液IL-1β、TNF-α、MMP-3含量。

    1.5 評分標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)Mankin評分對關(guān)節(jié)軟骨退變進行評分,評分標(biāo)準(zhǔn)如下:①結(jié)構(gòu):正常0分;表面不規(guī)則1分;血管翳形成,并且表面規(guī)則2分,深達移行層的裂隙3分,深達放射層的裂隙4分,深達鈣化層的裂隙5分,結(jié)構(gòu)完全紊亂6分;②細(xì)胞:正常0分,細(xì)胞彌漫性增生1分,細(xì)胞群集2分,細(xì)胞減少3分;③沙黃O染色:正常0分,輕度減弱1分,中度減弱2分,重度減弱3分,未著色4分;④潮標(biāo):完整0分,血管通過1分。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS15.0對數(shù)據(jù)進行分析,對計數(shù)資料采用χ2檢驗,對正態(tài)計量資料用“±s”表示,組間比較采用t值檢驗,多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有顯著性。

    2 結(jié)果

    2.1 大體觀察外部結(jié)構(gòu)及關(guān)節(jié)積液 白對照組軟骨表層光滑,光澤好無病變性反應(yīng),無關(guān)節(jié)積液產(chǎn)生,滑膜正常無增生情況。模型組及2玻璃酸鈉給藥組均出現(xiàn)滑膜組織增生、關(guān)節(jié)有積液、積液呈現(xiàn)淡黃色,軟骨無光澤且顏色變暗;且關(guān)節(jié)面出現(xiàn)不同程度的粗糙、潰爛及缺損等。各組評分結(jié)果見圖1。

    圖1 4組外部結(jié)構(gòu)及關(guān)節(jié)積液評分比較*P<0.05,與對照組比;#P<0.05,與模型組比;△P<0.05,與大分子組比Fig.1 Comparison of external structure and hydrarthrosis in four groups*P<0.05,compared with control group;#P<0.05,compared with model group;△P<0.05,compared with model group

    2.2 各組MRI檢查結(jié)果 正常組膝關(guān)節(jié)軟骨光滑完整且無關(guān)節(jié)積液及病變反應(yīng);模型組中軟骨層鼓面不完整,軟骨下骨裸露、硬化、有關(guān)節(jié)積液;大分子治療組中軟骨層變薄,表面不光滑,但未見關(guān)節(jié)積液;小分子治療組軟骨層有輕度變薄,表面略有粗糙,未見關(guān)節(jié)積液(見圖2)。

    圖2 MRI檢查結(jié)果Fig.2 Results of MRIexamination

    2.3 各組染色觀察結(jié)果

    2.3.1 阿爾藍(lán)染色及VG染色結(jié)果:對阿爾藍(lán)染色及VG染色切片的軟骨部分進行圖像定量分析,小分子組的蛋白聚糖OD值及骨膠原 OD值分別為(11.537±3.199)、(27.244±7.892),均優(yōu)于對照組及模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表 1)。

    表1 4組關(guān)節(jié)蛋白聚糖及骨膠原含量的定量分析相對值Tab.1 Aanalysis of relative joint proteoglycan and collagen contents in four groups

    2.3.2 各組關(guān)節(jié)沖洗液中IL-1β、TNF-α、MMP-3含量比較:采用ELISA法測定各組關(guān)節(jié)沖洗液中IL-1β、TNF-α、MMP-3含量,小分子組3種含量分別為:(47.6±11.0)、(91.7±17.5)、(43.7±7.2),明顯優(yōu)于對照組及模型組,且具有顯著差異性(P<0.05,見表2)。

    表2 各組關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、MMP-3含量比較(pg/mL)Tab.2 Comparison of joint fluid IL-1β,TNF-αand MMP-3 level in each group(pg/mL)

    2.3.3 各組軟骨退變Mankin評分比較:光鏡下對各組關(guān)節(jié)軟骨退變程度進行Mankin評分,結(jié)果見圖2。

    圖3 各組Mankin評分比較*P<0.05,與對照組比;#P<0.05,與模型組比Fig.3 Comparison of Mankin score*P<0.05,compared with control group;#P<0.05,compared with model group

    3 討論

    玻璃酸鈉在體內(nèi)分布廣泛,其主要分布在眼睛、皮膚、軟骨、關(guān)節(jié)滑液等組織,組織親和力強,具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種生物活性。大量臨床研究表明,玻璃酸鈉能夠顯著改善關(guān)節(jié)炎患者的運動障礙、關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)積液等。玻璃酸鈉能夠?qū)﹃P(guān)節(jié)進行潤滑并保護受損軟骨和抑制局部炎癥的發(fā)生。有報道表明:不同分子量玻璃酸鈉對于骨關(guān)節(jié)炎的治療作用存在差異[8];因此本實驗進行兔骨關(guān)節(jié)炎建模進而研究觀察分析大分子與小分子玻璃酸鈉的作用情況。本實驗通過建立外觀評分標(biāo)準(zhǔn),并結(jié)合MRI組圖觀察比較,表明玻璃酸鈉對骨關(guān)節(jié)炎存在顯著療效,并提示小分子量玻璃酸鈉在促進軟骨組織修復(fù)、減少滑膜組織增生的療效優(yōu)于大分子玻璃酸鈉組。

    Mankin評分能夠準(zhǔn)確界定骨關(guān)節(jié)炎模型的病期分期,是骨關(guān)節(jié)炎軟骨退化的理論依據(jù),本實驗通過Mankin評分所得,小分子玻璃酸鈉給藥組的病情程度顯著低于模擬組與大分子組。玻璃酸鈉在治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機制中有修復(fù)生理屏障、保護軟骨,促進自身玻璃酸鈉合成,修復(fù)軟骨的作用[9]。提示小分子玻璃酸鈉其作用效果優(yōu)于大分子玻璃酸鈉。近年來,臨床研究表明玻璃酸鈉在抑制滑膜炎癥中起到重要作用[9],本研究中2組治療組兔關(guān)節(jié)滑膜毛細(xì)血管增生及滑膜細(xì)胞減少方面均低于較模擬組,經(jīng)HE染色表明滑膜炎癥程度大分子組顯著大于小分子組。表明小分子組玻璃酸鈉能夠有效抑制兔膝關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)。炎性因子IL-1β、TNF-α在關(guān)節(jié)液中的含量水平與關(guān)節(jié)炎軟骨破壞嚴(yán)重程度有關(guān),是關(guān)節(jié)炎病理過程中促進軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要細(xì)胞因子[10]。IL-1β促進軟骨基質(zhì)的降解并抑制軟骨細(xì)胞對蛋白聚糖、骨膠原的合成,使軟骨結(jié)構(gòu)改變,引起軟骨缺損;TNF-α為作用活躍的致炎因子,能致關(guān)節(jié)軟骨損害、減少滑膜細(xì)胞凋亡并促其增值,是介導(dǎo)增生和形成血管翳、破壞軟骨及破壞骨質(zhì)的重要因子[11]。本實驗中,模擬組與給藥組的2種因子含量顯著高于對照組,P<0.05,差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義。大分子組與小分子組的兩種因子含量雖無顯著差異,但小分子組因子含量還是略低于高分子組。表明用玻璃酸鈉能減少關(guān)節(jié)內(nèi)IL-1β、TNF-α的合成,且小分子玻璃酸鈉能較好的抑制這類炎性因子的合成。另一方面,炎性因子MMP-3對蛋白聚糖具有高度裂解性,從而改變蛋白聚糖結(jié)構(gòu)降低其濃度[12]。通過炎性因子MMP-3濃度的降低及對阿爾藍(lán)染色、VG染色圖像分析的中蛋白聚糖及骨膠原相對含量分析,研究驗證小分子玻璃酸鈉的效果優(yōu)于大分子玻璃酸鈉。

    綜上所述,不同分子量玻璃酸鈉在治療骨關(guān)節(jié)炎方面均有確切療效,小分子量玻璃酸鈉在促進軟骨組織修復(fù)和減少滑膜組織增生方面具顯著優(yōu)勢,具有重要的臨床價值。

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    (編校:吳茜)

    Study on effect of two differentmolecular weight sodium hyaluronate on osteoarthriti

    CHENWen-ge

    (Department ofWrist Surgey,Minda Hospital Affiliated of Hubei Minzu University,Ensi445000,China)

    Objective To observe the therapeutic effect of two differentmolecular weight sodium hyaluronate on osteoarthritis.Methods Rabbit knee osteoarthritismodelwas constructed by using the method of intraarticular injection of papain,by pathological study,to evaluate the therapeutic effect of differentmolecular weight sodium hyaluronate on osteoarthritis.Results The lesions had therapeutic effect on osteoarthritis model of articular cartilage and synovialmembrane of 2 differentmolecular weight sodium hyaluronate in different degree,curative effect and smallmolecular weight of sodium hyaluronate in the treatment of osteoarthritis is better.Conclusion Sodium hyaluronate is safe and effective in treating osteoarthritis,the molecular weight of 80~1500000 Da of sodium hyaluronate in promoting repair of cartilage tissue,reduce the hyperplasia of synovial tissue and has more advantages.

    sodiumh yaluronate;differentmolecular weight;osteoarthritis;efficacy

    R197.32

    A

    1005-1678(2014)06-0066-03

    國家十一五計劃(2006BAI04A09)

    陳文革,男,本科,副主任醫(yī)師,研究方向:關(guān)節(jié)、創(chuàng)傷;E-mail:February3022@163.com。

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