RNA干擾技術(shù)在PAT家族蛋白研究中的應(yīng)用

趙志武,師磊,馬敏,燕炯

(山西醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院,山西 太原 030001)

RNA干擾技術(shù)在PAT家族蛋白研究中的應(yīng)用

趙志武,師磊,馬敏,燕炯Δ

(山西醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院,山西 太原 030001)

PAT家族蛋白包括perilipin、adipophilin、TIP47、S3-12和OXPAT 5種蛋白。研究發(fā)現(xiàn)這些蛋白定位于脂滴表面，介導脂質(zhì)代謝，并與肥胖癥、糖尿病等脂代謝疾病相關(guān)。RNA干擾是一種基因沉默技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用到生物醫(yī)藥領(lǐng)域，若能通過此技術(shù)制備相關(guān)生物制劑調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，將為緩解甚至治療脂代謝疾病提供新思路。本文旨在對RNA干擾技術(shù)在PAT家族蛋白研究中的應(yīng)用作一綜述。

RNA干擾；PAT家族蛋白；脂質(zhì)代謝

1 RNA干擾簡介

RNA干擾(RNA interference,RNAi)通過雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發(fā)同源mRNA高效特異地降解,是一種抑制正常生物體特定基因表達的現(xiàn)象［1］。該現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平,并且被證實與轉(zhuǎn)錄后基因沉默在分子水平上是同一種現(xiàn)象,因此又被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)。目前RNAi已成為基因功能研究的重要工具,并將在癌癥、遺傳和代謝等疾病的治療方面發(fā)揮重要作用。

1.1 RNA干擾的來源及發(fā)展 1990年,Napoli等［2］發(fā)現(xiàn)上調(diào)查耳酮合酶基因(色素產(chǎn)生基因)表達并沒有加深矮牽?；ɑㄉ?反而變?yōu)殡s色甚至白色。進一步研究發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因和同源內(nèi)生基因均被抑制,故把該現(xiàn)象定義為“共抑制”。1995年,Guo等［3］發(fā)現(xiàn)將正義或反義 RNA注入秀麗新小桿線蟲后均能有效并特異地抑制par-1基因的表達。1998年,Fire等［4］研究發(fā)現(xiàn)注射含有dsRNA的混合物比僅含正義或反義RNA更能有效沉默目標基因,并將這一現(xiàn)象命名為RNAi。2001年,Elbashir等［5］第一次證實合成的小干擾 RNA(small interference RNA,siRNA)能夠在哺乳動物細胞中誘導RNAi。次年,Brummelkamp等［6］首次利用小鼠 H1啟動子構(gòu)建了小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)表達載體pSUPER,并通過轉(zhuǎn)染該載體證實其可有效并特異地沉默哺乳動物細胞中靶基因的表達。截至目前,研究發(fā)現(xiàn)siRNA、shRNA和m icroRNAs(m iRNAs)均可引起RNAi。

1.2 RNA干擾的原理 在RNAi中,dsRNA通過降解靶mRNA來抑制目標蛋白的表達(見圖1)。其中,長鏈dsRNA通過 Dicer酶的作用,特異地裂解成 21～23 nt長度的siRNA［7］。siRNA在RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈,隨后反義siRNA再與內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等結(jié)合形成RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)［8］。以反義siRNA作為引導序列,按照堿基互補配對原則特異識別靶mRNA,并引導RICS與其結(jié)合。隨后,siRNA與靶mRNA在復合物中換位,Dicer酶將靶mRNA切割成21～23 nt的片段,從而特異地抑制靶基因的表達,造成基因沉默。此外,siRNA還可作為引物與靶mRNA結(jié)合并在RNA聚合酶作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer酶切割產(chǎn)生大量的siRNA,從而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng),最終將靶mRNA完全降解。

圖1 RNA干擾的原理Fig.1 Mechanism of RNAi

除了上述胞質(zhì)中Dicer酶裂解dsRNA產(chǎn)生siRNA之外,還有3種方式可以產(chǎn)生siRNA,分別為體外化學合成siRNA途徑、shRNA途徑和miRNA途徑。

1.3 siRNA與shRNA、miRNA之間的關(guān)系 shRNA前體在細胞核中合成并含發(fā)夾樣莖-環(huán)結(jié)構(gòu),其由運輸?shù)鞍?運入細胞質(zhì)后形成雙鏈siRNA,參與合成RISC。shRNA可以通過質(zhì)粒或病毒作為運載體而在細胞內(nèi)表達。此外,RISC中的shRNA與siRNA功能相似,但作用更持久。

miRNA前體與shRNA相似,均含莖-環(huán)結(jié)構(gòu)并由運輸?shù)鞍?運入細胞質(zhì)。miRNA前體在Dicer酶的作用下形成成熟miRNA。單種miRNA可通過不匹配綁定調(diào)節(jié)多種靶mRNA并引導RISC參與mRNA降解或抑制其翻譯［9］。

2 RNA干擾與PAT家族蛋白

PAT的取名來自于 perilipin、adipophilin和 TIP47(Tailinteracting protein 47)3種脂滴表面蛋白首字母的組合,此后又相繼發(fā)現(xiàn)2種蛋白:S3-12和OXPAT。PAT家族蛋白在維持脂滴功能和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用。當其出現(xiàn)異常表達時,脂質(zhì)代謝紊亂,可能引起諸如肥胖、2型糖尿病和動脈硬化等多種疾病。RNA干擾技術(shù)具有高效特異沉默目的基因的特點,將為研究PAT家族基因功能以及治療脂代謝異常疾病提供新方法。

2.1 RNA干擾與perilipin Perilipin是脂滴表面含量最多的一種可磷酸化蛋白,在能量及脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用。磷酸化的perilipin可改變脂滴表面結(jié)構(gòu),促使激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive lipase,HSL)與脂滴中甘油三酯接觸,加快其降解。近幾年研究發(fā)現(xiàn),perilipin在參與脂解時還與三酰甘油水解酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)、CGI-58(comparative gene identification-58)以及Fsp27(fat-specific protein 27)有關(guān)。

在脂解過程中,RNA干擾技術(shù)是研究perilipin基因功能的重要方法之一。為進一步驗證肝X受體介導脂解時下調(diào)perilipin表達這一現(xiàn)象,Stenson等［10］沉默perilipin后發(fā)現(xiàn)人類前脂肪細胞的脂解率升高,并且破壞肝X受體激動劑GW3965的作用。另外,研究發(fā)現(xiàn)perilipin可以通過調(diào)節(jié)CGI-58和ATGL來控制脂解。Granneman等［11］采用siRNA沉默perilipin后也出現(xiàn)脂解率升高的現(xiàn)象,而同時沉默CGI-58時會明顯減少該現(xiàn)象的發(fā)生。Yang等［12］采用相同方法發(fā)現(xiàn)成熟 3T3-L1細胞中ATGL的活性增強,脂肪酸和甘油量分別增加了3.5倍和2.3倍。最近,Sun等［13］在沉默perilipin的前脂肪細胞中發(fā)現(xiàn)脂滴明顯減小,甘油三酯含量下降近30%,隨后又通過相關(guān)RNAi實驗證實perilipin可通過激活Fsp27促進脂滴形成。此外,Lizaso等［14］還發(fā)現(xiàn)沉默perilipin會促進RAB7蛋白與脂滴結(jié)合,從而加快脂解。

2.2 RNA干擾與adipophilin Adipophilin又稱脂肪分化相關(guān)蛋白(adipose differentiation-related protein,ADRP),它是脂肪細胞分化時第一個出現(xiàn)的脂滴蛋白,其主要作用是參與脂滴形成以及維持甘油三酯的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn),采用siRNA沉默ADRP后會降低脂滴的聚集,增加胞內(nèi)外脂肪酸的β氧化［15］。此后,Bosma等［16］推測該現(xiàn)象可能是把增強脂肪酸氧化能力或減少脂肪酸的吸收作為對脂滴穩(wěn)定性下降的代償。另外,該研究還發(fā)現(xiàn)細胞中呼吸電子傳遞鏈和葡萄糖代謝增強,表明這種代償發(fā)生在線粒體功能基因的表達上。Sapiro等［17］在沉默ADRP的肝細胞中發(fā)現(xiàn)甘油三酯降解加快,脂肪酸含量升高。當單獨干預(yù)二十碳五烯酸、油酸鹽或牛血清蛋白時該細胞中PPARα活性顯著升高,因此作者認為:在外源性脂肪酸和底物干預(yù)時,甘油三酯加速分解會提高PPARα的活性。最近,Senthivinayagam等［18］為了證實ADRP拮抗劑對葡萄糖攝取的作用,分別在L細胞和已分化的3T3-L1細胞中沉默ADRP,結(jié)果這2種細胞中2-脫氧葡萄糖的最大攝入量分別增加了1.9倍和3倍,因此推測ADRP的表達與胞內(nèi)葡萄糖的攝取呈負相關(guān)。

Urahama等［19］研究發(fā)現(xiàn)ADRP可以保護腎小管細胞免受脂肪酸誘導的細胞凋亡。其中,通過沉默ADRP可以顯著加快由脂肪酸或混有亞油酸的脫脂白蛋白誘導的細胞凋亡。此外,ADRP還與單核細胞刺激的炎癥狀態(tài)和纖維基因的表達有關(guān)［20-21］。

2.3 RNA干擾與TIP47 RNAi介導的基因沉默也運用在TIP47的功能研究上。在沉默ADRP的MEFs(小鼠胚胎成纖維細胞)中,TIP47取代ADRP成為主要的脂滴PAT蛋白。當同時沉默TIP47和ADRP時,與僅沉默ADRP相比,總脂質(zhì)吸收量相似,但在分解甘油三酯時有更多的外源性脂肪酸轉(zhuǎn)化為磷脂［22］。由于不能充分說明TIP47自身的功能。隨后,Bell等［23］在AML12肝細胞株中對TIP47和ADRP進行了單獨和聯(lián)合沉默的處理。形態(tài)學分析結(jié)果表明:與對照組相比,僅沉默TIP47或ADRP的細胞中有大量的小脂滴,且沉默ADRP導致脂滴表面TIP47增加;在聯(lián)合沉默TIP47和ADRP的細胞中脂滴較大,數(shù)量較少,因此作者認為大脂滴的出現(xiàn)與脂滴融合失控有關(guān),從而突出了PAT蛋白乳化胞內(nèi)中性脂質(zhì)的作用。此外,聯(lián)合沉默加快了脂解,同時增加了ATGL和CGI-58的含量。

除了脂代謝研究外,TIP47還具有其他功能。Eniko Hocsak等［24］在研究紫杉酚誘導細胞死亡的實驗中沉默TIP47,結(jié)果證實缺乏TIP47可誘導紫杉酚促進細胞死亡。最近,Vogt等［25］采用shRNA沉默TIP47后發(fā)現(xiàn)感染丙肝病毒的Huh7.5肝癌細胞中丙肝病毒的RNA自主復制能力和增殖速度均顯著下降,因此認為TIP47是丙肝病毒RNA高效復制的必備物質(zhì)。Checkley等［26］在人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜糖蛋白結(jié)合研究中為評估TIP4的作用而將其沉默,結(jié)果表明其并不影響HIV-1包膜的結(jié)合、病毒的釋放和傳染性。另外,沉默TIP47還會減少前列腺素 E2 的產(chǎn)生［27］。

2.4 RNA干擾與S3-12、OXPAT S3-12和OXPAT是發(fā)現(xiàn)較晚的PAT家族成員。S3-12主要分布在白色脂肪組織小脂滴表面,研究發(fā)現(xiàn)該基因的一種單核苷酸多態(tài)性與身高有關(guān)［28］。OXPAT為perilipin的同源蛋白,在棕色脂肪組織、心臟、骨骼肌和肝臟中均表達,具有抑制脂類分解的作用［29］。此外,OXPAT還可以促進線粒體能量利用,降低心臟氧化負荷,其缺乏會抑制心肌脂質(zhì)積累［30-31］。截至目前,尚未查閱到相關(guān)文獻報道采用RNA干擾技術(shù)探究2者的基因功能以及在脂質(zhì)代謝中的作用。

3 展望

如今,RNAi已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因組學、信號轉(zhuǎn)導和疾病治療等領(lǐng)域,在醫(yī)藥衛(wèi)生研究中有著廣闊的前景。其中,在疾病治療領(lǐng)域,RNAi在病毒性疾病、遺傳性疾病以及腫瘤的治療應(yīng)用中均已發(fā)揮了重要作用。PAT家族作為脂代謝過程中重要的參與蛋白,已經(jīng)成為脂代謝相關(guān)疾病研究的重要靶點。若能以PAT家族作為生物制劑靶點,通過RNA干擾技術(shù)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,這將為肥胖癥、糖尿病等脂代謝疾病患者帶來福音,并發(fā)揮其科研、經(jīng)濟和社會價值。

［1］ Almeida R，Allshire RC.RNA silencing and genome regulation［J］.Trends Cell Biol，2005， 15（5):251-258.

［2］ Napoli C，Lemieux C，Jorgensen R.Introduction of chimeric chalcone synthase gene into Petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans［J］.Plant Cell，1990，2（4):279-289.

［3］ Guo S，Kemphues KJ.par-1，a gene required for establishing polarity in C.elegans embryos，encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distribute［J］.Cell，1995，81（4):611-620.

［4］ Montgomery MK，F(xiàn)ire A.Double-stranded RNA as a mediator in sequence-specific genetic silencing and cosuppression［J］.Trends Genet，1998，14（7):255-258.

［5］ Elbashir SM，Harborth J，LendeckelW，etal.Duplexes of21-nucleotide RNAsmediate RNA interference in cultured mammalian cells［J］.Nature，2001，411（6836):494-498.

［6］ Brummelkamp TR，Bernards R， Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells［J］.Science，2002，296（5567):550-553.

［7］ Bernstein E，Caudy AA，Hammond SM，et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference［J］.Nature，2001，409（6818):363-366.

［8］ Nyk?nen A， Haley B， Zamore PD.ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway［J］.Cell，2001，107（3):309-321.

［9］ Gao K，Huang L.Achieving efficient RNAi therapy:progress and challenge［J］.Acta Pharmaceutica Sinica B，2013，3（4):213-225.

［10］ Stenson BM，Rydén M，Venteclef N，et al.Liver X receptor（LXR)regulates human adipocyte lipolysis［J］.JBiol Chem，2011，286（1):370-379.

［11］ Granneman JG，Moore HP，Krishnamoorthy R，et al.Perilipin controls lipolysis by regulating the interactions of AB-hydrolase containing 5（Abhd5)and adipose triglyceride lipase（Atgl)［J］.J Biol Chem，2009，284（50):34538-34544.

［12］ Yang X，Heckmann BL，Zhang X，et al.Distinct mechanisms regulate ATGL-mediated adipocyte lipolysis by lipid droplet coat proteins［J］.Mol Endocrinol，2013，27（1):116-126.

［13］ Sun Z，Gong J，Wu H，etal.Perilipin1 promotes unilocular lipid droplet formation through the activation of Fsp27 in adipocytes［J］.Nat Commun，2013，4:1594-1624.

［14］ Lizaso A，Tan KT，Lee YH.β-adrenergic receptor-stimulated lipolysis requires the RAB7-mediated autolysosomal lipid degradation［J］.Autophagy，2013，9（8):1228-1243.

［15］ Larigauderie G， Cuaz-Pérolin C， Younes AB， et al.Adipophilin increases triglyceride storage in human macrophages by stimulation of biosynthesis and inhibition of beta-oxidation［J］.FEBS J，2006，273（15):3498-3510.

［16］ Bosma M，Hesselink MK，Sparks LM，etal.Perilipin 2 improves insulin sensitivity in skeletal muscle despite elevated intramuscular lipid levels［J］.Diabetes，2012，61（11):2679-2690.

［17］ Sapiro JM，Mashek MT，Greenberg AS，et al.Hepatic triacylglycerol hydrolysis regulates peroxisome proliferator-activated receptorα activity［J］.Lipid Res，2009，50（8):1621-1629.

［18］ Senthivinayagam S，McIntosh AL， Moon KC， et al.Plin2 inhibits cellular glucose uptake through interactions with SNAP23，a SNARE complex protein［J］.PLoSOne，2013，8（9):e73696.

［19］ Urahama Y，Ohsaki Y，F(xiàn)ujita Y，et al.Lipid droplet-associated proteins protect renal tubular cells from fatty acid-induced apoptosis［J］.Am J Pathol，2008，173（5):1286-1294.

［20］ Chen FL，Yang ZH，Wang XC，et al.Adipophilin affects the expression of TNF-α， MCP-1， and IL-6 in THP-1 macrophages［J］.Mol Cell Biochem，2010，337（1-2):193-199.

［21］ Lee TF，Mak KM，Rackovsky O，et al.Downregulation of hepatic stellate cell activation by retinol and palmitate mediated by adipose differentiation-related protein （ADRP)［J］.JCell Physiol，2010，223（3):648-657.

［22］ Sztalryd C，Bell M，Lu X，et al.Functional compensation for adipose differentiation-related protein（ADFP)by Tip47 in an ADFP null embryonic cell line［J］.JBiol Chem，2006，281（45):34341-34348.

［23］ Bell M，Wang H，Chen H，et al.Consequences of lipid droplet coat protein down regulation in liver cells:abnormal lipid droplet metabolism and induction of insulin resistance［J］.Diabetes，2008，57（8):2037-2045.

［24］ Hocsak E，Racz B，Szabo A，et al.TIP47 confers resistance to taxolinduced cell death by preventing the nuclear translocation of AIF and Endonuclease G［J］.Eur JCell Biol，2010，89（11):853-861.

［25］ Vogt DA，Camus G，Herker E，et al.Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein［J］.PLoSPathog，2013，9（4):e1003302.

［26］ Checkley MA，Luttge BG，Mercredi PY，et al.Reevaluation of the requirement for TIP47 in human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein incorporation［J］.J Virol，2013， 87 （6):3561-3570.

［27］ Nose F，Yamaguchi T， Kato R， et al.Crucial role of perilipin-3（TIP47)in formation of lipid droplets and PGE2 production in HL-60-derived neutrophils［J］.PLoSOne，2013，8（8):e71542.

［28］ Cusano NE，Kiel DP，Demissie S，et al.A Polymorphism in a gene encoding Perilipin 4 is associated with height but not with bone measures in individuals from the Framingham Osteoporosis Study［J］.Calcif Tissue Int，2012，90（2):96-107.

［29］ Brasaemle DL.Perilipin 5:putting the brakes on lipolysis［J］.J Lipid Res，2013，54（4):876-877.

［30］ Wang H，Sreenivasan U，Hu H，et al.Perilipin 5， a lipid dropletassociated protein，provides physical and metabolic linkage to mitochondria［J］.JLipid Res，2011，52（12):2159-2168.

［31］ Kuramoto K，Sakai F，Yoshinori N，et al.Deficiency of a lipid droplet protein，Perilipin 5， suppressesmyocardial lipid accumulation，thereby preventing type 1 diabetes-induced heart malfunction［J］.Mol Cell Biol，2014，［Epub ahead of print］.

(編校:吳茜)

App lication of RNA interference technology in the research of PAT proteins

ZHAO Zhi-wu,SHILei,MA Min,YAN JiongΔ

(School of Public Health,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)

PAT proteins contain perilipin,adipophilin,TIP47,S3-12 and OXPAT.Some researchers found that these proteins are located on the surface of lipid droplets and involved in the lipid metabolism,which is associated with lipid metabolic diseases such as obesity and diabetes.RNA interference,a kind of technology of gene silencing,has been widely used in biomedical fields.If we could produce biological agent to regulate lipid metabolism through this technology,we could provide a new way to treat lipid metabolic disorders.This paper reviewed the application of the RNA interference technology in the research of PAT proteins.

RNA interference;PAT proteins;lipid metabolism

Q591.5

A

1005-1678（2014)06-0178-04

趙志武，男，碩士，研究方向：公共衛(wèi)生，E-mail：842294911@qq.com；燕炯，通信作者，男，副教授，碩士生導師，研究方向：營養(yǎng)相關(guān)疾病分子學，E-mail：yanjiong@126.com。