PCR反向膜雜交法在CT、UU、NG三種性病篩查中的應用價值

王濤 王鵬 董麗

沙眼衣原體（CT）、解脲脲原體（Uu）及淋球菌（NG）是性病的主要病原體。近年研究表明，采用常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物，再采用膜雜交技術(shù)鑒定擴增產(chǎn)物，可保持雜交特異性，診斷正確率高[1-3]。本研究對1486例疑為泌尿生殖道感染的患者采用PCR反向膜雜交法篩查，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 1486例為2013年1月-2014年6月到本院治療的疑似泌尿生殖道感染患者，大部分患者存在外陰搔癢、不適等癥狀，已將1個月內(nèi)使用過抗支原體、衣原體藥物者剔除。其中男634例，女852例；年齡17~60歲，平均（33.6±5.7）歲。

1.2 檢測方法

1.2.1 儀器與試劑 人乳頭狀瘤病毒分型檢測試劑盒（深圳生化有限責任公司生產(chǎn)）；MJopticon2型FQPCR擴增分析儀及其配套試劑（美國生產(chǎn)）；CT快速檢測卡，UU、NG培養(yǎng)基（潮州凱普生物化學有限公司生產(chǎn)）。

1.2.2 標本采集 男性標本：將消毒棉拭子伸入受檢者尿道口中1~2 cm，旋轉(zhuǎn)10 s取分泌物。女性標本：將消毒棉拭子插入宮頸1~2 cm處，旋轉(zhuǎn)20 s取上皮細胞。男、女各取3份分泌物標本。

將其中兩份置入1 mL無菌生理鹽水試管中，加入2 mL漂洗液放入離心機中進行12 000 r/min離心處理15 min，隨后在離心沉淀中滴入50 μL DNA提取液，搖勻后放入100 ℃沸水中浸浴15 min；隨后再進行15 000 r/min離心處理10 min，取5 μL上清液進行擴增處理[4]。

另1份標本置入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，CT采用Hela-229及McCoy細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h；將UU培養(yǎng)基放入37 ℃左右的溫箱中培養(yǎng)，48 h后觀察標本顏色；NG接種于巧克力平板，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)，加入5%CO2，培養(yǎng) 24 h[5]。

1.2.3 PCR擴增反應 取處理好的上清液進行PCR擴增反應，均嚴格按照說明書要求操作。每次檢測均設陰性、陽性及空白對照。

1.2.4 膜雜交反應 （1）DNA變性：將20 μL DNA變形液加入擴增后的上清液中，搖勻放置2 min充分反應。（2）雜交：在酶板條第一排孔中加入40 mL雜交緩沖溶液A，按順序滴入10 μL變性DNA液，搖勻后插入對應雜交膜，于37 ℃恒溫箱中放置5~10 min。（3）洗膜：在酶板條第二排孔中滴入1滴雜交緩沖液B，將之前制成的雜交梳按序號置入，放入37 ℃恒溫箱中7~10 min。（4）酶結(jié)合：在酶板條第三排孔中滴入1滴SA-AP，按順序?qū)⑶懊娴诙烹s交梳插入對應孔中，放入25 ℃恒溫箱中7~10 min。（5）顯色：在酶板條第四排孔中分別滴入1滴顯色物液 A和顯色物底物液B，混勻后將之前第三排雜交梳插入對應孔中，放入25 ℃恒溫箱中5~10 min[6]。

1.2.5 FQ-PCR擴增反應 取1份離心處理后的上清液，按照試劑盒的操作要求置入反應管中，上機進行FQ-PCR擴增反應。反應條件為：93 ℃ 2 min預變性；93 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，10 個循環(huán)；93 ℃ 30 s，55 ℃45 s，30個循環(huán)[7]。每次檢測均設陰性、陽性及空白對照，以試劑盒中給出的DNA濃度作標準曲線，以此標準定量法測定。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件包對數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測結(jié)果 1486例患者中，培養(yǎng)法檢測出947例（63.73%）陽性，539例（36.27%）CT、UU、NG全陰性。FQ-PCR陽性率為70.25%，與培養(yǎng)法比較差異有統(tǒng)計學意義（ 字2=14.31，P<0.01）；PCR反向膜雜交法陽性率為66.96%，與培養(yǎng)法比較差異無統(tǒng)計學意義（字2=3.42，P>0.05）。FQ-PCR、PCR反向膜雜交法陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（字2=3.75，P>0.05）。見表1。

2.2 檢測敏感性及特異性 以培養(yǎng)法檢測結(jié)果作為金標準，F(xiàn)Q-PCR、PCR反向膜雜交法檢測的敏感性均為100%；FQ-PCR檢測的特異性為82.00%，PCR反向膜雜交法為91.09%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（字2=19.13，P<0.01）。見表 2。

表1 FQ-PCR、PCR反向膜雜交法檢測CT、UU、NG陽性率比較 例（%）

表2 FQ-PCR、PCR反向膜雜交法檢測敏感性及特異性 例（%）

3 討論

CT、UU及NG是性傳播疾病的主要病原體。然而，這3種病原體感染癥狀不典型，部分患者甚至無任何癥狀，這給病原學診斷帶來挑戰(zhàn)。本文嘗試采用PCR反向膜雜交法篩查CT、UU及NG三種性病[8]。

培養(yǎng)法是性病病原體檢測的常規(guī)方法，但其培養(yǎng)時間較長，一般需要2~3 d才能獲得檢測結(jié)果，同時其對檢測設備及操作要求較高[9-10]。FQ-PCR法以其簡便、微量、快速等優(yōu)勢而成為CT、UU、NG三種性病篩查的首選方法。FQ-PCR其是在原有PCR技術(shù)的基礎上，將熒光能量傳遞技術(shù)融合進來，通過電腦控制檢測實現(xiàn)了對擴增病原體的實時動態(tài)觀察，可較準確地反映病原體感染情況[11]。然而，F(xiàn)Q-PCR探針無法保持雜交特異性，在檢測中易產(chǎn)生非特異性及假陽性產(chǎn)物，使假陽性偏高。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，膜雜交技術(shù)逐漸應用于性病篩查中。PCR反向膜雜交技術(shù)應用DNA探針、核酸雜交，酶聯(lián)顯色等多種技術(shù)進行CT、UU、NG三種性病病原學檢測[12]。其利用PCR技術(shù)擴增產(chǎn)物，隨后采用核酸雜交、酶聯(lián)顯色對擴增產(chǎn)物進行鑒定，檢測準確性高[13]。本組中，PCR反向膜雜交法檢測陽性率略低于FQ-PCR，但兩組差異比較無統(tǒng)計學意義。由此可知，PCR反向膜雜交法檢與FQ-PCR有著同樣準確檢測優(yōu)勢。PCR反向膜雜交法中的擴增產(chǎn)物用生物素標記后，其固定在膜條上的特異性探針進行反向膜雜交，探針捕獲的生物素標記和流動相中的靶序列特異性結(jié)合，酶催化底物顯色，并在膜上顯出藍色斑點[14]。膜雜交技術(shù)需要在固相載體膜上交聯(lián)特異性探針能夠很好的保持雜交的特異性，同時在試劑盒中加入duTP和UDCT酶等可消除擴增產(chǎn)物被污染對結(jié)果的干擾，可克服FQ-PCR的缺點[15]。本組中，PCR反向膜雜交法與FQ-PCR檢測的敏感性均為100%，證實兩種方法均可作為CT、UU、NG三種性病篩查的敏感性方法。但PCR反向膜雜交法檢測特異性顯著高于FQ-PCR（P<0.01）。由此可知，PCR反向膜雜交法可避免FQ-PCR檢測所具有的假陽性偏高的缺點。

綜上所述，PCR反向膜雜交法篩查CT、UU、NG準確，快速，且篩查特異性高于FQ-PCR，值得臨床推廣適用。

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