大蒜素對誘癌Wister鼠模型腺窩異常病灶產(chǎn)生的影響分析

黃鑒，珠珠，李文亮，周銳澤，任俊宇，董堅

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，云南 昆明 650032）

大蒜素對誘癌Wister鼠模型腺窩異常病灶產(chǎn)生的影響分析

黃鑒，珠珠，李文亮，周銳澤，任俊宇，董堅Δ

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，云南 昆明 650032）

目的探討大蒜素對Wister鼠模型中腺窩異常病灶（abnormal crypt focus，ACF）的影響。方法60只Wister大鼠，按照20 mg/kg皮下注射二甲肼（dimethylhydrazine，DMH），每周1次，連續(xù)喂養(yǎng)18周。隨機(jī)分為大蒜素組和非大蒜素組，將每組分為3批，分別在開始用藥后8周、16周與24周分別處死大鼠，每批10只，美蘭染色后鏡片下觀察大腸組織。結(jié)果大腸被均等分為10份進(jìn)行觀察，ACF大部分分布于中段和遠(yuǎn)端，大約在50%～80%處。非大蒜素組的基本情況：8 周 ACF平均（63．97±1．22）個/只，16 周 ACF平均（83．97±1．13）個/只，24 周 ACF平均（69．33±2．01）個/只；大蒜素組的基本情況：8 周 ACF平均（9．4±1．12）個/只，16 周 ACF平均（7．17±1．33）個/只，24 周 ACF平均（4．97±1．23）個/只。非大蒜素組 ACF的發(fā)生情況顯著高于大蒜素組，2組ACF發(fā)生率和數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15．88，P＜0．01）。結(jié)論大蒜素可以明顯降低Wister大鼠腺窩異常病灶的發(fā)生數(shù)量，在一定程度上降低直腸癌的發(fā)生率，起到預(yù)防的作用。

大蒜素；Wister鼠模型；腺窩異常病灶；直腸癌

1.2 研究方法 制備Wister大鼠的異常腺窩病灶的模型：將購買的60只wister大鼠給予二甲肼處理，按照20 mg/kg的劑量進(jìn)行皮下注射，每周1次，連續(xù)持續(xù)18周，將所有的模型大鼠隨機(jī)分為大蒜素組和非大蒜素組，大蒜素組大鼠在第一次給予二甲肼處理后，按每天10 mg/kg體重給予大蒜素，灌腸，直至ACF模型大鼠被處死。

組織標(biāo)本的制備：在指定的時間采用脫頸椎的方法處死大鼠，取大鼠的直腸，用預(yù)冷的PBS洗干凈，將腸組織沿腸系膜縱向切開，然后固定于10%的多聚甲醛溶液中，然后放置于0.2%的亞甲藍(lán)溶液浸泡10～20 min，將染色后的腸組織轉(zhuǎn)移至載玻片上，通過顯微鏡進(jìn)行觀察ACF的數(shù)目[4]。

1.3 研究指標(biāo) 判斷異常腺窩病灶的標(biāo)準(zhǔn)：鏡下見腺管擴(kuò)大，上皮層增厚，腺管之間間距增大以及不規(guī)則的管腔和鏡下可見的輕微的隆起。腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)分型按照Sunter標(biāo)準(zhǔn)。觀察方法：大腸被分為均等的10份進(jìn)行觀察。從盲腸端開始為0，分別記為大腸長度的 10%(1%～10%)、20%(11%～20%)、30%(21%～30%)、40%(31%～40%)、50%(41%～50%) 、60%(51%～60%)、70%(61%～70%)、80%(71%～80%)、90%(81%～90%)、100%(91%～100%)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行，計量資料以“±s”來表示，對于服從正態(tài)分布，方差齊性的資料采用方差分析；計數(shù)資料采用秩和檢驗。檢驗標(biāo)準(zhǔn)取α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素組和非大蒜素組腫瘤的形成情況 2組在8 w時均未見腫瘤的形成，在第16 w時非大蒜素組在處死的10只里有2只在30%和40%處有腫瘤的形成，病理切片鏡下觀察為均為高分化腺癌，在第24 w時非大蒜素組中有8只鼠形成了腫瘤，其中有2只在在10%～20%處形成了低分化的粘液性的腺癌，其他6只在距盲腸50%～80%處形成了高分化性的腺癌；大蒜素組在第24 w處死的10只鼠中僅有1只，在距盲腸遠(yuǎn)端（60%～80%）形成了高分化性的腺癌見圖1。

圖1 2組腫瘤形成類型Fig.1 Types of tumor formation in two groups

2.2 大蒜素組和非大蒜素組腺窩異常病灶（ACF）的形成情況 大腸被均等分為10份進(jìn)行觀察，ACF大部分分布于中段和遠(yuǎn)端，大約在50%～80%處。非大蒜素組的基本情況：8周ACF平均（63.97±1.22）個/只，16周 ACF 平均（83.97±1.13）個/只，24周ACF平均（69.33±2.01）個/只；大蒜素組的基本情況：8周ACF平均（9.4±1.12）個/只，16周 ACF平均（7.17±1.33）個/只，24周ACF平均（4.97±1.23）個/只。根據(jù)基本的ACF的發(fā)生情況非大蒜素組明顯的高于大蒜素組，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)檢驗ACF的發(fā)生率以及數(shù)量在2組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.88，P＜0.01，見表1），說明大蒜素可以有效的預(yù)防腺窩異常病灶的發(fā)生。

表1 ACF在2組的分布情況Tab.1 Distribution of ACF in two groups

3 討論

直腸癌是臨床上常見的消化道的惡性腫瘤，近幾年發(fā)病率逐年上升，死亡率也隨之升高，嚴(yán)重影響患者的健康和生命，早期對于直腸癌患者進(jìn)行干預(yù)對于患者的治療具有重要意義[5]。腺窩異常病灶是1987年首次被發(fā)現(xiàn)[6]，在制作小鼠的結(jié)腸癌模型時經(jīng)過亞甲藍(lán)染色后在光鏡下呈現(xiàn)單個或者多個比正常腺窩增大增深的異常腺窩。后來對對異常腺窩病灶進(jìn)行定義就是指在嚙齒類動物或者人類的結(jié)直腸組織中在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)的單獨出現(xiàn)或者呈簇出現(xiàn)的異常的腺窩，與正常的腺窩組織不同，主要表現(xiàn)為使用亞甲藍(lán)染色后腺管的顯色比較深、腺窩異常擴(kuò)大、面積增大、上皮層增厚、突出于上皮表面呈隆起狀、腺管開口可以呈現(xiàn)不同的形狀如鋸齒、橢圓和裂隙等[7]。由于腸組織的異常腺窩病灶出現(xiàn)較早，可以作為直腸癌患者早期診斷的一項指標(biāo)[8]。有研究表明在人類的直腸癌患者的檢出率很高，在健康人的檢出率為15%～77%，而在結(jié)直腸腫瘤患者中的檢出率可達(dá)到100%，而且隨著結(jié)直腸癌患者病程的進(jìn)展，異常腺窩病灶的的數(shù)目隨之增加，當(dāng)使用葉酸、維生素等抗癌藥物后，異常腺窩病灶的數(shù)目相應(yīng)的減少，當(dāng)給予吸煙、喝酒等于消化道腫瘤相關(guān)的刺激因子誘導(dǎo)后，患者的異常腺窩病灶增加，可以提示異常腺窩病灶對于結(jié)直腸癌患者的診斷、治療、及預(yù)后評價具有一定的指導(dǎo)價值。

大蒜抑制被認(rèn)為是具有疾病預(yù)防和治療作用的食物，大蒜素是其主要成分[9]，大蒜素是一種具有多項生物功能的物質(zhì)，主要是來自大蒜的鱗型球莖中提取的油狀液體，具有可揮發(fā)性，是目前研究的比較熱的天然抗腫瘤的物質(zhì)之一[10]，其有效成為為有機(jī)硫化物，主要包括二烯丙基一硫化物、二烯丙基二硫化物和二烯丙基三硫化物[11]。很多報道顯示大蒜素具有抗腫瘤[12]、抗細(xì)胞凋亡、抗細(xì)菌真菌感染、提高機(jī)體免疫力等作用.目前研究比較肯定的是大蒜素在前列腺癌中的作用，顯示大蒜素能明顯減輕前列腺癌模型小鼠的疾病進(jìn)程，改善其病理狀況[13]。同時其與其他化療藥物聯(lián)合給藥能促進(jìn)化療藥物的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用[14]。對于消化道腫瘤中大蒜素的應(yīng)用目前研究比較少，而且大部分研究出現(xiàn)了很多矛盾的地方，尤其是大蒜素不同的成分對于異常腺窩病灶的影響，有的研究顯示二烯丙基一硫化物能減少異常腺窩病灶的生成，有的則報道二烯丙基一硫化物不僅不會減少異常腺窩病灶的數(shù)目而且會增加，也有研究顯示二烯丙基二硫化物可以減少異常腺窩的生成，我們認(rèn)為這種矛盾結(jié)果的提出可以能與大蒜素不同的程度對于直腸癌的作用不同而導(dǎo)致的。

在我們的研究中我們使用二甲肼誘導(dǎo)wister大鼠的直腸癌模型，觀察組患者在同時給予大蒜素處理，對照組大鼠不給于大蒜素處理，結(jié)果顯示2組大鼠在8周時均未見腫瘤形成，大蒜素組24周處死的10只老鼠中只有1只出現(xiàn)腫瘤，而非大蒜素組24周處死的10只老鼠中有8只出現(xiàn)了腫瘤，提示大蒜素可以延緩腫瘤的發(fā)生。而且分別在8周、16周、24周處死的老鼠中非大蒜素組的老鼠的異常腺窩病灶的數(shù)目明顯高于大蒜素組，提示大蒜素對已直腸中異常腺窩病灶的產(chǎn)生具有重要作用，可以減少其產(chǎn)生，對于腸道異常腺窩病灶的出現(xiàn)具有預(yù)防作用，提示大蒜素可以作為一種預(yù)防直腸癌的癌前病變有一定的預(yù)防作用[15]。

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Effect of allicin on abnormal crypt focus production in carcinogenesis Wister rat model

HUANG Jian，ZHU Zhu，LI Wen-liang，ZHOU Rui-ze，REN Jun-yu，DONG JianΔ

(Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, China)

ObjectiveTo study the influence of the allicin on abnormal crypt focus(ACF). in Wister rat model.Methods60 Wister rats were subcutaneous injected by dimethylhydrazine (DMH), according to 20 mg/kg weight, once a week, feeding 18 weeks continuously. All of the rats were randomly divided into allicin group and non-allicin group, each group was divided into three groups evenly, and put to death at 8, 16 and 24 weeks after medication separately. Large intestines were observed after dyeing.ResultsLarge intestines were divided into ten equally, and all pieces were observed. ACF were almostly distributed in the middle and distal of the large intestines, about in 50%-80%.The basic situation of non-allicin group was as follows: ACF at 8 weeks was 63.97±1.22 on average per each, 16 weeks was 83.97±1.13, 24 weeks was 69.33±2.01. The basic situation of allicin group: ACF at 8 weeks was 9.4±1.12 on average per each , 16 weeks was 7.17±1.33, 24 weeks was 4.97±1.23.The occurrence of ACF in nonallicin group was higher than allicin group, the differences of incidence rate and number of ACF between two groups was significant (χ2= 15.88，P＜0.01).ConclusionAllicin can significantly reduce the number of ACF in Wister rats, lower the incidence of colorectal cancer, has prevention effect.

allicin; Wister rat model; abnormal crypt focus; colorectal cancer

R 735．3

A

1005-1678(2014)02-0065-03

腺窩異常病灶是在誘導(dǎo)嚙齒動物直腸癌模型中發(fā)現(xiàn)的有別于正常腺管的現(xiàn)象，如腺管擴(kuò)大、上皮組織較正常厚、腺管之間的距離擴(kuò)大及不規(guī)則的突起[1]，常常將異常腺窩病灶是腸癌早期最早發(fā)現(xiàn)的粘膜病變，可以是單個的病灶，也可以是聚集在一起的多個病灶，異常腺窩病灶的數(shù)目和狀況對于腫瘤發(fā)生發(fā)展具有一定的提示作用，也可以作為治療效果的一個指標(biāo)[2]。大蒜素是大蒜的主要成分，具有抗腫瘤、治療心血管疾病、提高免疫力等多方面功能[3].在本研究中我們通過二甲肼誘導(dǎo)wister大鼠腸癌，探討使用大蒜素進(jìn)行處理后對腺窩異常病灶產(chǎn)生的影響。

1 資料與方法

1.1 Wister鼠模型的構(gòu)建和用藥 60只斷乳的6周齡雄性大鼠，體重100～140 g，由四川大學(xué)動物中心購得(許可證號：2008A046)。飼養(yǎng)于SPF環(huán)境（即無特定病原體動物是不攜帶潛在感染或條件致病菌），所有的大鼠都以標(biāo)準(zhǔn)固定的飼料，自由飲水，光照時間、濕度、室溫分別為12 h、45%、24.5℃，動物都分籠飼養(yǎng)。所用致結(jié)腸癌物為二甲肼（DMH，購自sigma公司），臨用前溶于0.9%的生理鹽水（含0.1%DMSO）中，配制成8 mg/mL DMH的溶液，濃度大約2%，再用碳酸氫鈉調(diào)至pH 6.5左右備用，用藥標(biāo)準(zhǔn)為20 mg/kg。

黃鑒，男，博士在讀，主治醫(yī)師，研究方向：結(jié)直腸癌規(guī)范化治療，E-mail：jhwang921@gmail.com；董堅，通信作者，女，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤生物治療和干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究學(xué)，E-mail：dongjian18@yahoo.com。