蒽貝素聯(lián)合阿霉素對乳腺癌細胞MCF-7增殖和荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響

李宗祥，孫平

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430070）

蒽貝素聯(lián)合阿霉素對乳腺癌細胞MCF-7增殖和荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響

李宗祥，孫平Δ

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430070）

目的探討阿霉素（doxorubicin，DOX）聯(lián)合X連鎖凋亡抑制蛋白小分子抑制劑蒽貝素（embelin，EB）對乳腺癌細胞MCF-7增殖及荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響。方法根據(jù)加入藥物的不同將MCF-7細胞分為生理鹽水組、阿霉素干預(yù)組、蒽貝素干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組（蒽貝素＋阿霉素）。MTT法檢測各組對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響。流式細胞術(shù)檢測各組腫瘤細胞凋亡情況。構(gòu)建乳腺癌MCF-7細胞腫瘤球模型，探討阿霉素聯(lián)合蒽貝素對腫瘤球的生長抑制作用。建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型，探討阿霉素聯(lián)合蒽貝素對乳腺癌異位瘤的生長抑制作用。結(jié)果乳腺癌MCF-7細胞在給藥后48h，聯(lián)合干預(yù)組對腫瘤細胞的增殖抑制率顯著大于其他給藥組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；細胞凋亡實驗和腫瘤球生長抑制實驗都表明聯(lián)合干預(yù)組的腫瘤細胞抑制能力顯著強于其他組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；荷瘤小鼠實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合干預(yù)組的腫瘤生長抑制作用顯著強于其他組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論阿霉素與蒽貝素均具有抑制乳腺癌增殖的作用，2者聯(lián)合應(yīng)用能夠發(fā)揮協(xié)同作用，增強抗腫瘤能力。

阿霉素；蒽貝素；乳腺癌

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（美國GIBCO公司）；阿霉素（浙江海正藥業(yè)，批號：14202）；蒽貝素（美國 sigma公司）；其余試劑為分析純。人源乳腺癌細胞（MCF-7，ATCC）。雌性裸鼠（20～30 g，購自武漢大學(xué)實驗動物中心，合格證號：WHDX20102372）。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌MCF-7細胞的培養(yǎng)：將MCF-7細胞置于含有100mg／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，飽和濕度，溫度為37℃。待細胞匯合度為0.8～0.9時，用2.5mg／L胰蛋白酶消化傳代，取增殖期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT檢測不同藥物對腫瘤細胞的增殖抑制作用：將MCF-7細胞分為生理鹽水組、阿霉素干預(yù)組、蒽貝素干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組（蒽貝素＋阿霉素）。培養(yǎng)MCF-7細胞，接種于96孔板中，當(dāng)孔板中細胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時分別加入無菌過濾后的蒽貝素溶液（40mmol／mL）、阿霉素溶液（15mmol／mL）和蒽貝素（40mmol／mL）＋阿霉素（15 mmol／mL）溶液。將孔板移入37℃5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后取出，每孔加入20μL 5 g／LMTT溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4 h。將孔板中液體倒出，每孔加入200μL DMSO，37℃避光振搖15min，用酶標儀在490 nm處測定各孔的吸光度值（A）。

1.2.3 細胞凋亡檢測：按“1.2.2”方法培養(yǎng)細胞并分組，給藥后將MCF-7細胞繼續(xù)培24 h，用冰PBS清洗細胞3次，F(xiàn)ITC／PI雙染，細胞避光放置15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡數(shù)量。

1.2.4 腫瘤球生長變化檢測：取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，用0.125%的胰酶消化，含血清的培養(yǎng)基中和胰酶，輕輕吹打細胞后離心，棄上清。加培養(yǎng)基重懸細胞，接種于低熔點瓊脂糖預(yù)處理的96孔板。37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)。腫瘤球生長7 d后，加入無菌過濾后的蒽貝素溶液（40 mmol／mL）、阿霉素溶液（15mmol／mL）和蒽貝素（40mmol／mL）＋阿霉素（15 mmol／mL）溶液。以生理鹽水為陰性對照，統(tǒng)計腫瘤球體積大小變化。腫瘤球體積變化率 ＝（Vn－V0）／V0。

1.2.5 乳腺癌異位腫瘤模型的建立：MCF-7細胞經(jīng)胰酶消化離心后，懸浮于DMEM培養(yǎng)液，細胞計數(shù)，調(diào)節(jié)濃度至5×107個／mL。取4～6周齡，體質(zhì)量20～30 g的雌性裸鼠60只，于皮下接種于裸鼠背部，每只裸鼠接種0.1mL細胞懸濁液。接種后1～2周可見背部長出腫瘤塊，證明接種成功。將優(yōu)選后的40只荷瘤裸鼠隨機分成4組，分別腹腔注射蒽貝素溶液（40mmol／mL）、阿霉素溶液（15mmol／mL）和蒽貝素（40mmol／mL）＋阿霉素（15mmol／mL）溶液各 1mL，第 3、6、9、12天給藥。第21天處死小鼠，剖腫瘤，稱重。計算抑瘤率腫瘤組織切片，TUNEL染色，照相。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.0進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)以“±s”表示，2組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各處理組對MCF-7細胞的增殖抑制作用 MTT結(jié)果顯示：阿霉素和蒽貝素均能顯著抑制MCF-7細胞的增殖（P＜0.05），且隨著時間延長抑制率逐漸上升（P＜0.05）。聯(lián)合干預(yù)組對腫瘤細胞的增殖抑制能力顯著高于各單獨給藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見圖1）。

圖1 不同藥物干預(yù)組對MCF-7細胞的增殖抑制率＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，與生理鹽水組比較；**P＜0.01，與蒽貝素組和阿霉素組比較；ΔP＜0.01，與聯(lián)合干預(yù)組相比Fig.1 MCF-7 cell viability at various drugs at24 h and 48h after the treatment＃P＜0.01，compared with saline group；**P＜0.01，compared with embelin group and doxorubicin group；ΔP＜0.01，compared with combination group（doxorubicin＋embelin）at24 h

2.1 各處理組對MCF-7細胞的凋亡作用 流式檢測結(jié)果顯示：與生理鹽水組相比，阿霉素、蒽貝素和聯(lián)合干預(yù)組均能不同程度誘導(dǎo)乳腺癌細胞的凋亡（P＜0.01）。且聯(lián)合干預(yù)組誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡率顯著強于2單獨干預(yù)組組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見圖2）。

圖2 不同藥物干預(yù)誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡率ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，與生理鹽水組比較；**P＜0.01，與阿霉素組和蒽貝素組相比Fig.2 MCF-7 cells induced apoptosis by embelin and doxorubicin ΔP＜0.01，compared with saline group；**P＜0.01，compared with embelin group and doxorubicin group

2.2 各處理組對腫瘤球生長的抑制作用 腫瘤球的生長抑制實驗結(jié)果顯示：阿霉素和蒽貝素均能明顯抑制腫瘤球的生長，且聯(lián)合干預(yù)組對腫瘤球生長抑制率顯著高于其他2組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見圖3）。

圖3 不同藥物干預(yù)對腫瘤球生長抑制率**P＜0.01，與蒽貝素組和阿霉素組相比Fig.3 The inhibition of tumor spheroids by embelin and doxorubicin**P＜0.01，compared with embelin group and doxorubicin group

2.4 各處理組對裸鼠皮下移植腫瘤生長的作用 對荷瘤裸鼠的治療實驗表明，聯(lián)合干預(yù)組對腫瘤生長的抑制率顯著強于其他組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見表1）。各組裸鼠腫瘤組織切片后TUNEL染色，棕色代表凋亡的腫瘤細胞，圖4可見，聯(lián)合干預(yù)組誘導(dǎo)凋亡的腫瘤細胞最多，其次是阿霉素干預(yù)組和蒽貝素干預(yù)組。

表1 不同藥物干預(yù)對乳腺癌移植瘤的抑制率Tab.1 The inhibition of breast tumor by different drugs

圖4 腫瘤組織切片TUNEL染色（×200）Fig.4 TUNEL staining of tumor tissues（×200）

3 討論

蒽貝素是近年來發(fā)現(xiàn)的一種有效的小分子XIAP抑制劑，其抗腫瘤活性已經(jīng)得到了廣泛關(guān)注。鄭玲等［10］觀察了蒽貝素對人胰腺癌細胞的抑制效應(yīng)，結(jié)果顯示蒽貝素具有良好的誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡的作用。史朝暉等［11］觀察了蒽貝素對大腸癌細胞的增殖抑制效果，得到了相同的結(jié)果。本研究將阿霉素與蒽貝素聯(lián)合用于乳腺癌的治療研究。研究結(jié)果表明，阿霉素聯(lián)合蒽貝素能夠有效抑制MCF-7腫瘤細胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。在某些實體腫瘤組織中，由于腫瘤組織致密生長，腫瘤內(nèi)部壓力高且血管少，因此抗腫瘤藥物很難進入腫瘤組織深部［12-15］。本研究構(gòu)建了體外乳腺癌腫瘤球模型用于評價聯(lián)合給藥的抑制腫瘤生長的能力。結(jié)果顯示，與生理鹽水組比較，蒽貝素和阿霉素都能夠抑制腫瘤球的生長，聯(lián)合給藥比各單獨給藥更能有效抑制腫瘤球的生長。

綜上，本研究首先通過體外細胞實驗驗證了聯(lián)合給藥對乳腺癌細胞的增殖抑制作用。腫瘤細胞增殖抑制實驗、腫瘤球生長抑制實驗和細胞凋亡實驗結(jié)果都表明聯(lián)合給藥能夠增強乳腺癌細胞的增殖抑制作用，促進腫瘤細胞凋亡。其次，構(gòu)建了乳腺癌異位腫瘤模型，通過考察腫瘤的生長抑制、腫瘤組織切片觀察聯(lián)合給藥對腫瘤的抑制和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡情況，得到了與體外實驗一致的結(jié)論：阿霉素聯(lián)合蒽貝素能夠顯著提高對乳腺癌的治療效果。

［1］ Arteaga CL，Winnier，Poirier MC，et al.p185c-erbB-2 signal enhances cisplatin-induced cytotoxicity in human breast carcinoma cells：association between an oncogenic receptor tyrosine kinase and druginduced DNA repair［J］.Cancer Res，1994，54（14）：3758-3765.

［2］ Cheung PY，Yip YL，Tsao SW，et al.Id-1 induces cell invasiveness in immortalized epithelial cells by regulating cadherin switching and Rho GTPases［J］.JCell Biochem，2011，112（1）：157-168.

［3］ Ji X，Wang Z，Geamanu A，etal.Inhibition of cell growth and induction of apoptosis in non-small cell lung cancer cells by delta-tocotrienol is associated with notch-1 down-regulation［J］.JCell Biochem，2011，112（10）：2773-2783.

［4］ Husain K，F(xiàn)rancois RA，Yamauchi T，et al.Vitamin Eδ-Tocotrienol augments the antitumor activity of gemcitabine and suppresses constitutive NF-κB activation in pancreatic cancer［J］.Mol Cancer Ther，2011，10（12）：2363-2372.

［5］ Chitra M，Sukumar E，Suja V，et al.Antitumor，anti-inflammatory and analgesicproperty of embelin，a plant product［J］.Chemotherapy，1994，40（2）：109-113.

［6］ Lu J，Huang Y，Zhao W，et al.PEG-derivatized embelin as a nanomicellar carrier for delivery of paclitaxel to breast and prostate cancers［J］.Biomaterials，2013，34（5）：1591-1600.

［7］ Schaible AM，Traber H，Temml V，et al.Potent inhibition of human 5-lipoxygenase and microsomal prostaglandin E2synthase-1 by the anticarcinogenic and anti-inflammatory agentembelin［J］.Biochem Pharm，2013，86（4）：476-486.

［8］ Naik SR，Niture NT，Ansari AA，et al.Anti-diabetic activity of embelin：involvement of cellular inflammatory mediators，oxidative stress and other biomarkers［J］.Phytomedicine，2013，20（10）：797-804.

［9］ Kalyan KG，Dhamotharan R，Kulkarni NM，et al.Embelin reduces cutaneous TNF-αlevel and ameliorates skin edema in acute and chronic model of skin inflammation in mice［J］.Eur J Pharmacol，2011，662（1-3）：63-69.

［10］ 鄭玲.XIAP抑制劑Embelin體外對人胰腺癌細胞株的抑制效應(yīng)與機制研究［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，40（1）：20-22.

［11］ 史朝暉.Embelin對大腸癌細胞株SW480細胞增殖和凋亡的影響［J］.腫瘤防治研究，2012，39（8）：954-956.

［12］ Jiang X，Xin H，Gu J，et al.Solid tumor penetration by integrinmediated pegylatedoly（trimethylene-carbonate）nanoparticles loaded with paclitaxel［J］.Biomaterials，2013，34：1739-1746.

［13］ Li J，F(xiàn)eng L，F(xiàn)an L，et al.Targeting the brain with PEGPLGA nanoparticlesmodified with phage-displayed peptides［J］.Biomaterials，2011，32（21）：4943-4950.

［14］ Kuai R1，Yuan W，Li W，et al.Targeted delivery of cargoes into a murine solid Tumor by a cell-penetrating peptide and cleavable poly（ethyleneglycol）comodified liposomal delivery system via systemic administration［J］.Mol Pharma，2011，8（6），2151-2161.

［15］ Kuai R1，Yuan W，Qin Y，etal.Efficient delivery of payload into tumor cells in a controlled manner by TAT and thiolytic cleavable PEG comodified liposomes［J］.Mol Pharm，2010，7（5）：1816-1826.

（編校：吳茜）

Effect of embelin and doxorubicin on the proliferation of MCF-7 cell and grow th of MCF-7 bearing nudem ice

LIZong-xiang，SUN PingΔ

（Hospital of Central China Agricultural University，Wuhan 430070，China）

ObjectiveTo explore the effect of X-linked inhibitor of apoptosis protein（XIAP）combined with doxorubicin on the proliferation of MCF-7 cell and growth of MCF-7 bearing nude mice.MethodsThe anti-proliferation efficiency of doxorubicin and embelin were determined by MTT assay.MCF-7 cell apoptosis induced by embelin and doxorubicin were detected by Flow cytometry.Anti-tumor ability of embelin and doxorubicin were evalued with tumor spheroids test.MCF-7 cell were xenografted to mice to establish the animal model，which was used to evaluate the effect of antitumor.ResultsCompared with saline group，embelin group and doxorubicin group，the combination（doxorubicin＋embelin）group inhibited the growth of MCF-7 cells effectively（P＜0.01）.The combination group induced the apoptosis of MCF-7 cellsmore effectively than doxorubicin alone（P＜0.01），and significantly inhibit the growth of tumor in vitro and in vivo than other groups（P＜0.01）.ConclusionThe combination of doxorubicin and embelin may be used as a potentially effective treatmentmethod for breast cancer.

doxorubicin；embelin；breast cancer

R737.9

A

1005－1678（2014）04－0005－04

乳腺癌是目前危害婦女健康的主要惡性腫瘤，發(fā)病率占女性惡性腫瘤的25%～30%，并呈逐年上升趨勢［1-2］。目前，乳腺癌的治療以手術(shù)為主，聯(lián)合化療為輔。然而，以細胞毒性為主的化學(xué)治療缺乏選擇性，難免產(chǎn)生許多不良反應(yīng)，導(dǎo)致病人對化療的依從性較差。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）是近年來備受矚目的一類蛋白質(zhì)家族，是一類獨立于Bcl-2的抗凋亡蛋白。某些IAPs成員異常高表達常引起細胞凋亡受阻，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3-5］。X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitorof apoptosis protein，XIAP）是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑。X連鎖凋亡抑制蛋白是腫瘤細胞內(nèi)抑制凋亡發(fā)生的重要蛋白之一［6］。蒽貝素是一種XIAP的小分子抑制劑，能夠通過抑制XIAP，進而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［7-9］。阿霉素是目前臨床上常用的抗腫瘤藥物，已經(jīng)被用于乳腺癌的治療，然而由于其心臟毒性，其應(yīng)用受到一定的限制。本研究將蒽貝素與阿霉素聯(lián)用，旨在探討他們對乳腺癌的治療作用。

國家自然科學(xué)基金（81171365）

李宗祥，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤疾病的基礎(chǔ)與臨床治療，E-mail：lizongxiang1975＠163.com；孫平，通信作者，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤疾病的基礎(chǔ)與臨床治療，E-mail：2094252562＠qq.com。